結(jié)核病病原學(xué)診斷評價方法探討
——與《結(jié)核病病原學(xué)分子診斷專家共識》作者商榷

楊蕾 王國治 盧錦標(biāo)

如何更好地利用分子生物學(xué)診斷報告服務(wù)臨床診斷，是困擾臨床工作者的難題。為此，中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會臨床檢驗專業(yè)委員會組織實驗室和臨床領(lǐng)域的專家對分子生物學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域的重要問題進行了討論，撰寫了《結(jié)核病病原學(xué)分子診斷專家共識》(簡稱“《共識》”)[1]，并刊于《中華結(jié)核和呼吸雜志》2018年第41卷第9期。該《共識》有助于臨床工作者與結(jié)核診斷試劑研究人員更好地理解最新2017版《WS288—2017 肺結(jié)核診斷》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，以及提高結(jié)核病診療人員對分子生物學(xué)診斷技術(shù)實驗室結(jié)果的解讀能力。但筆者對《共識》中分子診斷與微生物病原學(xué)診斷的評價標(biāo)準(zhǔn)與評價結(jié)果存在疑義，望與專家探討。

《共識》[1]認(rèn)為：“目前已有的結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)中，不同檢測技術(shù)的最低檢出限值存在較大差異：GeneXpert方法為131 CFU/ml(注：“CFU”為“菌落形成單位”)，MTB培養(yǎng)為100 CFU/ml，其他分子生物學(xué)檢測方法為101～103CFU/ml，臨床標(biāo)本涂片為103～104CFU/ml。因此，臨床檢測標(biāo)本時，任何一種分子生物學(xué)檢測方法結(jié)果陽性、細菌學(xué)檢測方法陰性時，應(yīng)以分子生物學(xué)檢測結(jié)果為準(zhǔn)，視為MTB陽性。”該推論所引用的分子診斷的評價方法不夠合理，細菌學(xué)診斷提供的數(shù)據(jù)有明顯錯誤[2]，以不合適的論據(jù)推出的結(jié)論既不嚴(yán)謹(jǐn)也不可能準(zhǔn)確。

1. 以CFU為基數(shù)計算敏感度不妥。結(jié)核病分子診斷無論死菌或活菌均可檢測出陽性結(jié)果，因此，以CFU為基數(shù)計算敏感度遺漏了死菌可能產(chǎn)生的陽性結(jié)果，分子診斷實際檢測細菌個數(shù)多于培養(yǎng)出的CFU數(shù)，導(dǎo)致計算的檢出率虛高。依據(jù)本室檢測，以結(jié)核分枝桿菌PCR檢測試劑盒用國家參考品最低檢出量參考品為參照，GeneXpert方法最低檢出量為1×103個菌/ml～1×104個菌/ml，高于用CFU/ml描述的數(shù)值。

2.以CFU/ml為分子診斷檢測評價單位時不合理的另外一個原因。CFU是菌落形成單位。1個菌落可以由1個菌形成，也可以由成百上千個結(jié)核分枝桿菌組成的菌團形成。結(jié)核分枝桿菌本身就呈分枝狀生長，研磨過細可能導(dǎo)致菌體死亡；研磨太粗則形成菌團的可能性大增，而菌團則會導(dǎo)致檢測結(jié)果虛高。

3.任何檢測試劑要達到100%的特異度幾乎不可能，分子診斷技術(shù)難以完全克服污染的問題。《共識》中提到等溫(恒溫)擴增技術(shù)：“敏感度高但特異度相對較低，對防污染措施要求嚴(yán)格，其自動化程度越高，檢測結(jié)果可信度越高[1]。”顯然，簡單認(rèn)定“分子生物學(xué)檢測方法結(jié)果陽性、細菌學(xué)檢測方法陰性”時必須認(rèn)可“分子生物學(xué)檢測結(jié)果”是有缺陷的。

4. 《共識》[1]提供細菌學(xué)診斷的敏感度為“MTB培養(yǎng)為100 CFU/ml”，但該處所引的文獻依據(jù)實際提供的數(shù)據(jù)是“培養(yǎng)法的敏感度明顯高于涂片法，該方法可檢出10個細菌/ml[2]”。理論上，所有結(jié)核病分子診斷都需一定數(shù)量的起始菌方可檢出，但培養(yǎng)基中接種上1個活菌就能生長，并且采用膜過濾集菌方式、液體培養(yǎng)等方法還能進一步提高活菌檢出率。正常情況下，培養(yǎng)的檢出敏感度要求需高于100 CFU/ml。《共識》引用文獻的數(shù)據(jù)[2]提示：培養(yǎng)法的檢出敏感度要求要高于《共識》提供的分子診斷法。高檢出敏感度要求的方法“細菌培養(yǎng)”未檢出，并不能排除低檢出敏感度要求的方法“分子診斷”檢出的陽性是假陽性的可能。

5.分子診斷技術(shù)的特異度易受多種因素的影響，不僅僅與標(biāo)本處理和實驗室交叉污染有關(guān)，還與檢測機理、檢測靶標(biāo)的特異性、引物設(shè)計、擴增次數(shù)的設(shè)置、陽性判斷值灰區(qū)值的設(shè)置等都有關(guān)。現(xiàn)在商業(yè)化試劑的防污染措施和陰性對照僅能排除某些非結(jié)核分枝桿菌假陽性和交叉污染的影響。一般來說，不同分子生物學(xué)方法檢測的特異度不同，檢測結(jié)果的可信度也不同。

綜上所述，《共識》提出“任何一種分子生物學(xué)檢測方法結(jié)果陽性、細菌學(xué)檢測方法陰性時，應(yīng)以分子生物學(xué)檢測結(jié)果為準(zhǔn)，視為MTB陽性”的結(jié)論無法成立。

事實上，我們并不排除細菌學(xué)檢測陰性分子生物學(xué)檢測陽性的結(jié)果多數(shù)是正確的診斷。但是，其原因與分子診斷方法無論死菌或活菌都能得出相同的結(jié)果提高了核酸陽性檢出率有關(guān)，與培養(yǎng)方法本身受條件與技術(shù)限制影響了培養(yǎng)陽性檢出率有關(guān)，卻與專家組提出的證據(jù)無關(guān)。建議專家重新收集、整理匯總國內(nèi)外研究的相關(guān)數(shù)據(jù)并修訂上述結(jié)論。

同時，應(yīng)認(rèn)識到，與其他方法學(xué)診斷一樣，除了要關(guān)注檢測方法的時效性、簡便性與自動化程度外，病原生物學(xué)診斷最關(guān)鍵的依然是方法檢測結(jié)果的“敏感度”與“特異度”。就結(jié)核病病原學(xué)分子診斷而言，由于不同分子診斷技術(shù)的機理不一樣，各廠家研發(fā)技術(shù)水平不同，不同檢測試劑的敏感度與特異度有很大差異。

本室對國內(nèi)已經(jīng)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的結(jié)核病病原學(xué)分子診斷試劑用同一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測的結(jié)果表明，敏感度最高的檢測試劑在10個菌/ml時即可檢出，敏感度最低的檢測試劑需要104個菌/ml時才能檢出。據(jù)最新發(fā)表的數(shù)據(jù)，專家認(rèn)可的檢測敏感度高的檢測試劑及方法，如：Xpert MTB/RIF Ultra，盡管敏感度較前一代產(chǎn)品有所提升[3]，但對培養(yǎng)陽性標(biāo)本檢測的陽性率也只有88%[4]。

建議《共識》撰寫專家組對不同試劑盒敏感度的差異是否會影響臨床檢測結(jié)果、目前結(jié)核病分子診斷學(xué)與細菌學(xué)檢測結(jié)果的關(guān)聯(lián)性提出指導(dǎo)性的意見，否則將無法滿足《共識》專家組提出的“提高結(jié)核病診療人員對分子生物學(xué)診斷技術(shù)實驗室結(jié)果的解讀能力”的基本要求。我國各級結(jié)核病防治機構(gòu)收治患者的陽性檢出率不一，在分子診斷與細菌培養(yǎng)敏感度相當(dāng)?shù)那闆r下，“肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性率達到50%以上[5]”的目標(biāo)恐難以實現(xiàn)。