Xpert MTB/RIF檢測技術在結核病診斷中的價值

周喜桃 張躍軍 曾莉怡 龍云鑄

結核病是由結核分枝桿菌(MTB)引發的全球性嚴重危害公共衛生問題的慢性傳染病之一， 2018年WHO全球結核病報告中估算，2017年全球的結核病潛伏感染人群約為17億，潛伏感染率為23%；全球新發結核病患者約1000萬例，約50%的新發患者來自于印度(27.4%)、中國(8.9%)、印度尼西亞(8.4%)和菲律賓(5.8%)；中國耐藥結核病患病例數位居世界第二，耐藥結核病患者新發比例達7.1%，高于世界平均水平[1]。 我國第五次結核病流行病學抽樣調查報告發現，93.1%的結核病患者首診單位為綜合醫院及下級基層醫療機構[2]；但由于結核病患者的臨床癥狀差別很大，在綜合性醫院因典型結核病臨床表現就診的患者越來越少，往往因不同癥狀或其他疾病就診于相關科室、科別，增加了臨床的診治難度，也容易造成結核病的傳播。而利用快速、可靠、特異度和敏感度高的檢測方法是進行臨床早期診斷、合理治療、及時阻斷傳播的重要措施。2010年12月WHO正式推薦使用GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert法”)作為一種全新的結核病快速檢測新方法用于結核病及利福平耐藥的檢測，得到了廣泛認可[3]。本研究比較分析Xpert法、夾層杯液基集菌涂片抗酸染色鏡檢法(簡稱“夾層杯法”)和傳統固體羅氏培養法(簡稱“固體培養法”)在肺內外標本檢測中的結果，評價Xpert法在綜合性醫院早期診斷和治療結核病中的應用價值。

資料和方法

一、研究資料

收集2016年6月至2017年8月入住湖南省株洲市中心醫院各科室376例疑似結核病患者的各類標本，分別進行Xpert法、夾層杯法和固體培養法的檢測，其中痰標本227份(60.37%)，肺泡灌洗液109份(28.99%)，腦脊液21份(5.59%)，胸腔積液15份(3.99%)，其他標本4份(1.06%，包括引流液、膿液、分泌物、尿液各1份)。376例疑似結核病患者中，男252例(67.02%)、女124例(32.98%)，年齡15～92歲，中位年齡為65歲；來自于感染內科患者213例(56.65%)，呼吸科121例(32.18%)，以及心血管內科、心胸外科、神經內科、神經外科、風濕免疫科、中西醫結合科、代謝分泌科等其他科室患者共計42例(11.17%)。依照《臨床診療指南：結核病分冊》[4]，結合患者臨床表現、影像學檢查、實驗室檢查及最終治療結果進行疑似結核病和臨床確診結核病的診斷。最終臨床確診結核病349例，非結核病27例。

二、儀器與試劑

夾層杯法液基抗酸桿菌檢驗試劑盒由湖南省天騎醫學新技術有限公司生產和提供；分枝桿菌萋爾-尼爾遜(Ziehl-Neelson)涂片鏡檢染色液、中性羅氏培養基均由珠海貝索生物技術有限公司提供；Xpert MTB/RIF系統為美國Cepheid公司的產品，檢測試劑盒由湖南省長沙中圣有限公司提供(原裝進口)。

三、標本的采集及檢測方法

1.標本采集：教授患者留取痰液標本方法(清晨患者先用清水漱口，深吸氣然后用力呼出，從肺部深處咳出痰液)，采集患者深部晨痰，用一次性無菌杯收集送檢(疑為肺結核患者連續3 d取痰標本進行夾層杯涂片鏡檢)；肺內灌洗液、腦脊液等其他標本用一次性無菌離心管或一次性無菌杯送檢。

2.夾層杯法：(1)標本的處理：各類標本按照夾層杯法液基抗酸桿菌檢驗試劑盒的操作說明書進行涂片、染色和鏡檢，參照《結核病實驗室標準化操作與網絡建設》[5]進行。(2)抗酸染色結果的判斷(抗酸桿菌染成紅色、非抗酸桿菌及細胞等染成藍色)：涂片結果根據鏡檢抗酸桿菌的數量多少[5]進行分級報告，連續采用100倍油鏡觀察300個不同視野，未發現抗酸桿菌(AFB)者為陰性、發現AFB者為陽性。

3.固體培養法：(1)標本的處理：采用“中和離心法”處理后的各類標本，取0.1～0.3 ml混懸液同時接種于2支羅氏斜面培養基進行分枝桿菌培養，接種第3、7天時各觀察1次菌落生長情況，此后每周觀察1次直至8周，操作嚴格參照《結核病實驗室標準化操作與網絡建設》[5]進行。對培養生長出的可疑菌落進行抗酸染色，陽性者送湖南省結核病醫院進行菌種鑒定和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)。

4.Xpert法：(1)標本的處理和檢測：痰標本按1∶2比例加入Xpert MTB/RIF樣品處理液中，在渦旋振蕩器上振搖20 s，靜置15 min；肺泡灌洗液及腦脊液、胸腔積液、膿液、分泌物、引流液等其他類型標本分別用無菌離心管離心半徑10 cm，4000 r/min離心15 min。取沉淀物1～2 ml備用，然后取已備用沉淀物按1∶2比例加入Xpert MTB/RIF樣品處理液中，在渦旋振蕩器上振搖20 s，靜置15 min。將處理好的標本用無菌吸管吸取2 ml，緩慢加入Xpert MTB/RIF檢測試劑盒中，放入儀器開始檢測。2 h反應結束后，報告MTB檢出情況和利福平耐藥結果。(2)結果的判定：Xpert法檢測結果依照儀器內探針的循環閾值(Ct值)判斷，Ct值≤38時即為MTB陽性，并可進一步按照Ct值對MTB進行半定量：Ct值<16為高含量，Ct值16～22為中含量，Ct值22～28為低含量；Ct值>28為極低含量；Xpert法檢測利福平耐藥的基礎在于MTB特異性分子信標早期Ct值和晚期Ct值之差(即ΔCT值)，ΔCt值>3.5時提示利福平耐藥，ΔCt值≤3.5時對利福平敏感，只有在MTB陽性的情況下才能檢測利福平耐藥情況。如有試驗結果顯示為無法判斷、無結果、無效或錯誤時，重新留取標本進行檢測。

四、質量控制

各標本的前期處理均按《結核病實驗室標準化操作與網絡建設》[5]要求在生物安全柜內進行，無過度處理、標本污染現象存在。痰涂片鏡檢按照實驗室標準化操作中操作和質量保證要求，實施了痰涂片盲法復檢和室內質控。MTB培養所使用的羅氏培養基每批次均分別接種陽性質控菌株結核分枝桿菌標準減毒株H37Ra(ATCC25177)和陰性質控菌株大腸桿菌(ATCC25922)進行檢測，合格后方可使用。Xpert MTB/RIF系統每個檢測匣定期進行樣品處理質量控制(SPC)和探針質量控制(PCC)，來確保樣品經過正確處理和探針符合指定的接受標準，保證檢測系統合格。

五、統計學處理

采用SPSS 19.0軟件對資料進行數據處理，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、3種檢測方法的陽性檢出情況及陽性率的比較

本研究對376例疑似結核病患者的不同類型標本同時采用Xpert法、夾層杯法和固體培養法進行檢測：Xpert法檢測陽性共141例，其中假陽性1例(Xpert法陽性、極低含菌量且利福平耐藥、痰涂片和培養均為陰性；經臨床確診為肺癌后取痰標本重新檢測為陰性，排除結核病)，其余140例經臨床確診均為結核病；夾層杯法檢測陽性共86例，其中4例 Xpert法陰性并經臨床診斷排除結核病，其余82例Xpert法均為陽性并經臨床確診為結核病；固體培養法檢測陽性共67例，Xpert法均為陽性并均經臨床確診為結核病。

本研究中Xpert 法總體陽性率(37.50%，141/376)明顯高于夾層杯法(22.87%，86/376)和固體培養法(17.82%，67/376)，差異均有統計學意義(χ2值分別為19.09、36.39，P值均<0.05)；夾層杯法總體陽性率與固體培養法比較，差異無統計學意義(χ2=2.96，P>0.05)。140例Xpert 法陽性且確診為結核病的患者中，分別有136例肺結核患者和4例肺外結核患者。

336例疑似肺結核的標本中，Xpert法的陽性率(40.77%，137/336)分別高于夾層杯法(25.60%，86/336)和固體培養法(19.94%，67/336)，差異均有統計學意義(χ2值分別為17.46、34.49，P值均<0.05；夾層杯法與固體培養法比較，差異無統計學意義(χ2=3.06，P>0.05)；40例疑似肺外結核標本中Xpert法陽性率為10.00%(4/40)，夾層杯法和固體培養法均未檢出，未進行統計學分析。詳見表1。

二、3種檢測方法檢測MTB的效能評價

以結核病臨床診斷為標準，Xpert法、夾層杯法、固體培養法檢測的總體敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、一致性檢驗(Kappa檢驗)見表2。Xpert法檢測敏感度[40.11%(140/349)]明顯高于夾層杯法[23.50%(82/349)](χ2值=19.86，P<0.05)和固體培養法[19.20%(67/349)](χ2值=35.98，P<0.05)，Xpert法檢測結果與臨床診斷結果的一致性(K=0.080 )明顯高于夾層杯法(K=0.016)與固體培養法(K=0.033)。

三、140例Xpert法檢測陽性與不同級別含菌量患者與夾層杯法和固體培養法的比較

140例Xpert法檢測陽性患者中，包含夾層杯法的82例和固體培養法陽性的63例；MTB含菌量級別比例從高到低依次為高含菌量8.57%(12/140)、中含菌量35.00%(49/140)、低含菌量32.14%(45/140)、極低含菌量24.29%(34/140)；其中4例肺外結核患者的MTB含菌量均為極低含量，夾層杯法和固體培養法均為陰性。詳見表3。

表1 不同標本采用3種方法檢測的陽性檢出率比較

注其他標本指引流液、膿液、分泌物、尿液

表2 以臨床確診結果為標準3種檢測方法檢測MTB的效能

注敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%

表3 Xpert法檢出不同陽性含菌量級別在夾層杯法和固體培養法中的分布情況

140例Xpert法檢測陽性患者中，極低、低含菌量級別患者共79例，高、中含菌量級別患者共61例。極低、低含菌量級別患者的夾層杯法檢出率為32.91%(26/79)，明顯低于高、中含菌量級別患者的檢出率[91.80%(56/61)]，差異有統計學意義(χ2=49.20，P<0.05)；極低、低含菌量級別患者的固體培養法檢出率為12.66%(10/79)，明顯低于高、中含菌量級別患者的檢出率[86.89%(53/61)]，差異有統計學意義(χ2=76.63，P<0.05)。

四、Xpert法檢測利福平耐藥結果

140例Xpert法檢測MTB陽性患者中，耐利福平患者22例，耐藥率為15.71%；同時有63例經固體培養法檢出MTB，通過比例法藥敏試驗獲得耐利福平MTB菌株9例，耐藥率為14.29%，兩種方法檢測MTB對利福平的耐藥率相近，差異無統計學意義(χ2=0.07，P>0.05)。且培養法中對利福平的耐藥患者均與Xpert 法對利福平的耐藥情況一致。

五、Xpert法陽性患者的臨床科室分布情況

140例Xpert法檢測陽性患者在明確診斷前，分布于院內各個臨床科室。以感染內科(65.72%，92/140)和呼吸內科(25.71%，36/140)多見；其他分別為神經內科3例、心血管內科2例、中西醫結合科2例、神經外科2例、心胸外科1例、風濕免疫科1例、代謝內分泌科1例，共計12例(8.57%)。

討 論

目前，我國結核病的實驗室診斷方法主要有涂片抗酸染色鏡檢、分枝桿菌培養和分子生物學等檢測方法。涂片抗酸染色鏡檢法雖然操作簡單、經濟，但敏感度和特異度均較低，容易漏檢；分枝桿菌培養法雖然是結核病診斷的“金標準”，但耗時長；普通的PCR技術容易發生交叉污染，假陽性率高，對結核病的診斷價值不高。當前實驗室檢測雖然可用夾層杯液基集菌涂片抗酸染色法替代直接涂片法和一些儀器微生物快速檢測系統，一定程度上達到提高陽性率和縮短培養時間[6-7]的目的，但仍無法滿足臨床診療的需要，如何能早期、快速、準確地檢測出各類臨床標本中的MTB及其耐藥性成為臨床迫切的需要。

隨著分子生物學技術的發展，由美國開發的一種新型Xpert MTB/RIF全自動檢測系統解決了這一問題，能在2 h內從患者標本中直接檢出是否含有MTB及該菌是否對利福平耐藥[8-9]。本研究中，Xpert法檢測的總陽性率(37.23%)和在各類標本中的陽性檢出率均明顯高于夾層杯法和固體培養法，差異均有統計學意義；尤其對于肺外標本，由于肺外標本中含菌量都非常低，夾層杯法和固體培養法檢查均為陰性。本研究中疑似肺結核患者均連續采取痰標本3次(行支氣管纖維鏡患者同時取灌洗液)進行夾層杯法檢測，且夾層杯法采用離心集菌后涂片，僅1次陽性即可判定該患者涂片陽性，而固體培養法只采取了1次標本進行培養，因此夾層杯法陽性率高于固體培養法，但差異無統計學意義。本研究以臨床確診結核病的診斷結果為標準，發現Xpert法檢測MTB的敏感度及一致性均明顯高于夾層杯法和固體培養法，與相關報道[10]結果相似。由此可見，Xpert法檢測MTB在篩查結核病和臨床應用價值方面優于夾層杯法和固體培養法，能更好地幫助早期診斷和治療菌陰結核病。

Xpert法檢測MTB的臨床檢出閾值低，據相關研究報道[11]，處理后的標本抗酸染色通常需5×103CFU/ml才能得到陽性結果，而Xpert法檢測只需131 CFU/ml即可檢出。Xpert法陽性的含菌量級別依次分為高、中、低和極低含量4個級別，本研究將Xpert法對不同菌量級的檢測結果與夾層杯法和固體培養法的檢測結果進行統計分析，發現140例Xpert法陽性標本中，高、中、低和極低含量分別占8.57%、35.00%、32.14%和24.29%，極低、低含菌量級別的比例高于高、中含菌量級別；其中12例“高”、49例“中”、45例“低”、34例“極低”級別標本中采用夾層杯法和固體培養法檢出率分別為100.00%和100.00%、89.80%和83.67%、48.89%和22.22%、11.76%和0.00%，隨著標本中含菌量級別的降低其夾層杯法和固體培養法檢出率均依次降低。由此說明，Xpert法檢測含菌量級別越低，夾層杯法和固體培養法越難檢出，Xpert法可大大提高低含菌量標本的陽性率，且Xpert法陽性例數基本覆蓋夾層杯法和固體培養法的檢出結果。

隨著耐藥菌株的增多，耐多藥結核病(MDR-TB)也逐漸增多，而大部分對利福平耐藥的菌株也同時對異煙肼耐藥，因此可以將利福平耐藥性的檢測作為MDR-TB的監測指標[12-13]。傳統MTB藥敏試驗需要對菌株分離培養后進行，結果報告耗時長。從本研究可以看出，Xpert法可快速測定對利福平的耐藥情況，140例Xpert法陽性標本中利福平耐藥檢出率為15.71%，與相關文獻相近[14-18]；并與金標準“比例法”的耐藥率(14.28%)差異無統計學意義，且培養法中對利福平的耐藥患者均與Xpert 法對利福平的耐藥情況一致，能為臨床醫生治療方案的選擇及時提供依據，對MTB的耐藥性檢測更具有優勢。

目前，多重耐藥菌株已經成為醫院感染的重要病原菌。在綜合性醫院中，對一些常見多重耐藥菌(如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌、多重耐藥腸桿菌科細菌等)已開展了常規的監測，但對MTB及MDR-TB的監測開展尚不多見[19]。在綜合性醫院中，結核病患者由于臨床表現不同，加之部分患者因基礎性疾病就診，往往就診的科室不同，需在相關科室通過各項檢查后才能初步診斷，給結核病的防控帶來一定難度，能否快速診斷結核病成為一個敏感問題。從本研究可以看出，有34.28%的結核病患者是因為臨床表現不典型和其他基礎性疾病分布于各個科室，在明確診斷之前并未按結核病預防隔離要求嚴格采取措施；而結核病主要通過人際間傳播，且MDR-TB患者治療難度大、療程長、痰菌陰轉率低、持續排菌，使新感染者成為原始耐藥者[20-22]，可造成嚴重的流行病學和公共衛生后患；使得如何及早診斷、掌握耐藥情況和科室院內暴露情況，及時進行預防隔離對控制結核病的醫院感染具有重要意義。

由此可見，Xpert法具有快速、簡單、敏感度高，且生物安全要求不高，能同時檢測利福平耐藥情況等優點，并能提高低含菌量標本的檢出率，可更好地輔助臨床醫生及早診療和及時預防隔離。因此，該技術在試驗條件的低要求、可靠性、早診療、醫院感染預防控制等方面都值得在綜合性醫院中推廣，特別是實驗室條件不成熟和標本量不多的基層醫院更值得推廣使用。