生物納米材料透射電鏡樣品制備條件研究

2021-11-01 05:52:02厲艷君吳立敏郝玉紅

實驗室研究與探索 2021年9期

厲艷君，吳立敏，周瑩，陳鷹，郝玉紅

（上海市計量測試技術研究院，上海 201203）

0 引言

作為微觀結構的一種重要分析表征手段，透射電子顯微技術（TEM）以其超高的分辨能力和直觀性廣泛應用于材料、醫學、生物和地質科學等研究領域，具有不可取代的地位［1-4］。對于蛋白、膠束、脂質體等生物納米材料，由于其主要組成元素是C、H、N、O等，這些元素原子序數低，散射電子能力較弱，與作為背景的碳支持膜之間襯度差異很小，導致其信噪比較低，拍出來的照片對比度小，而且樣品易受輻照損傷，難以直接用電鏡觀測。通常要用染色的方法來增加圖像的襯度。

負染色技術最早于1959 年由Brenner 等提出［5-6］。與傳統的正染不同的是，樣品進行負染時，樣品與染液之間不發生反應，故樣品本身并不著色。利用樣品與染色劑密度的懸殊對比，在電子致密的黑色背景中能反襯出低電子密度的白色樣品，形成負反差，故稱其為負染色［7］。負染色技術具有操作簡單、快速方便，可較好的保存樣品結構，使被染樣品反差適中、分辨率高，且樣品與染液用量少等優點，被廣泛應用于病毒、蛋白質晶體、高分子聚合物等的分析［8］，是一項十分重要的實驗技術。但是，由于染色效果與染色劑的成分、濃度、pH值、染色方式、染液用量、染色時間等息息相關，染色效果具有一定的隨機性，常常需要多次嘗試才能獲得理想的染色效果。為了達到更好的實驗效果，不斷有人就電子染色的方法進行研究和改進［9-14］。

在提高染色效果的同時，還有通過適當的方法，不用染色，直接觀測到樣品。如周劍鋒等［15］提出了一種無需染色的“負像法”表征聚丙烯酸酯類乳膠的方法。該方法基于丙烯酸酯類聚合物熱黏、冷脆的結構特性，通過短時烘烤，直接獲得了樣品類似負染效果的電鏡圖片，方便、快捷，同時避免了負染過程中可能引入的假象。Kraft等［16］采用金膠體修飾樣品表面，通過觀察金勾勒出的輪廓，直接觀察到脂肪酸微凝膠的形貌。王素麗［17］利用計算機算法，減少圖像中噪聲的影響，增強反差，提高圖像的襯度。另外，新的電鏡技術冷凍電鏡技術（Cryo-EM），可以將樣品包埋在玻璃態冰中，觀察到親水生物材料在近乎自然狀態下的形貌，減少了染色過程中引入的假象。

本文從調節染色條件的最常見的染液選擇、碳支持膜的處理、樣品濃度、染色時間出發，研究不同條件下可能出現的一些現象，從而有針對性地調節染色條件，為有效利用TEM 表征生物納米材料提供參考依據，得到更真實可靠、滿足分析要求的高質量照片。

1 實驗部分

1.1 試劑與設備

試劑：脂質體（Drmercola），磷鎢酸（北京中鏡科儀），醋酸雙氧鈾（Electron Microscopy Sciences）。

儀器：輝光放電儀（ELCO easiGlowTMGlow Discharge，Ted Pella，USA），場發射透射電子顯微鏡（TECNAI G2，FEI，USA）。

1.2 實驗方法

脂質體分散液的配制：稱取1 g脂質體，加入9 mL雙蒸水后，超聲20 min 使充分分散，用濾膜過濾后待用。

醋酸雙氧鈾染液的配制：稱取1 g醋酸鈾晶體，加入99 mL雙蒸水后，在黑暗中放置30 min，充分溶解后用濾膜過濾，得到1%的醋酸鈾水溶液，放在棕色瓶中待用。

負染操作的主要步驟如圖1 所示。將適合濃度的脂質體樣品溶液滴在碳支持膜上，停留一段時間后用濾紙將多余溶液吸除，再滴加去離子水洗漂洗，用濾紙吸干，并迅速滴上染液，使染液與支持膜上的樣品顆粒充分接觸，然后用濾紙將多余染液吸除，將樣品室溫干燥待用。

圖1 負染基本流程圖

2 實驗結果與討論

2.1 不同染液對染色的影響

分別用1%濃度的醋酸雙氧鈾和磷鎢酸對脂質體進行染色，尋找合適的區域拍照，得到結果如圖2 所示。用醋酸雙氧鈾與磷鎢酸染色都可以在樣品上找到背景為黑色，顆粒為白色的區域，顆粒輪廓清晰，反差明顯，兩種染液都能獲得較好的染色效果。磷鎢酸染色的樣品，碳膜上染色區域染液沉積厚度過渡較平緩，碳膜完整；用醋酸雙氧鈾染色的樣品，染色區域較多，對比度較明顯，但碳支持膜易破裂。醋酸雙氧鈾溶液見光易分解［18］，不易保存，需要現用現配，具有一定的放射性和毒性，且試劑價格昂貴。磷鎢酸染液配制簡便，易于存儲。在染色效果差不多的情況下，采用磷鎢酸溶液進行染色。

圖2 不同染液染色后的TEM圖

2.2 碳膜處理方式對染色的影響

將磷鎢酸水溶液直接滴在碳支持膜上，在染色區域可以看到如圖3（a）所示的白色顆粒。由圖3（a）可見，即使是沒有樣品的銅網，經過染色，也會出現大量的白色球形顆粒。這些顆粒，可能是染液和碳膜表面接觸在碳膜上形成的納米氣泡。研究表明，在固液界面之間，有納米氣泡存在［19-21］且納米氣泡主要在疏水表面富集。長時間放置在空氣中的碳支持膜，就是一個光滑的疏水表面，當磷鎢酸水溶液滴在上面時，在碳-水界面上很可能聚集一些納米氣泡，即圖3（a）所觀察到的白色顆粒。這種白色球形顆粒，與很多生物納米材料經染色后的形貌非常相似，極易與樣品混淆，在實際應用中應盡量避免。把碳支持膜放入輝光放電儀放電30 s后，再滴加磷鎢酸水溶液，觀察銅網，可以看到染色區域中的白色顆粒大大減少，如圖3（b）所示。該結果說明，增加碳支持膜的親水性，可以減少這種假象的產生。在碳支持膜上先滴一滴乙醇溶液潤濕，再滴加磷鎢酸水溶液進行染色，電鏡觀察發現，染色區域白色顆粒也明顯減少，如圖3（c）所示。用輝光放電或者乙醇潤濕，都能增加碳膜的親水性，減少在納米氣泡在碳膜表面的聚集，從而減少在染色過程中出現白色球形顆粒。因此，滴加樣品前，最好對碳支持膜進行親水化處理，避免一些因為界面氣泡而產生的假象。同時，對于分散在水溶液中的納米生物材料樣品，碳膜親水化處理也能幫助樣品更均勻地分散在支持膜上。

圖3 不同碳膜處理方式染色后的TEM圖

2.3 樣品濃度對染色的影響

將濃度為1%的維C脂質體分散液滴在碳支持膜上，用磷鎢酸染色后，形貌如圖4（a）所示，樣品形貌非常雜亂，看不出顆粒的具體形態?？赡苁菢悠窛舛冗^高，顆粒難以有效分散，在碳膜上團聚堆疊，染液無法與樣品充分接觸，染色后選擇性地顯示出部分輪廓線，無法觀察到樣品的真實形貌。稀釋10 倍以后，濃度為0.1%的脂質體分散液染色后形貌如圖4（b）所示，樣品分散較好，較少發生變形，顆粒輪廓清晰，數量較多，分布適宜，由圖像可以分析脂質體的形態、粒徑大小及分布狀況。稀釋100 倍以后，濃度為0.01%的脂質體分散液染色后形貌如圖4（c）所示，樣品分散好，顆粒輪廓清晰，但是數量很少，一個視野下只能找到幾個顆粒，沒有代表性。樣品過稀，沉積在支持膜上的樣品數量過少，無法在一個視野中獲得足夠數量的顆粒，這就導致實驗隨機性太高，對形貌與粒徑分布分析缺乏代表性和說服力，而且加大電鏡拍照尋找顆粒的難度。不同的樣品所需要的濃度是不一樣的，這與樣品顆粒的粒徑大小、表面電荷、分散性等都有關系，在實驗中針對具體的樣品可根據拍攝情況進行相應的調整。

圖4 不同濃度樣品染色后的TEM圖

2.4 染色時間對染色的影響

染色時間過短，在銅網上只能找到很少的染色區域，可供觀察的區域很少，染色區域沒連續的黑色背景區域，只在顆粒附近有很淡的灰色，染色效果有點類似于“正染”，很多顆粒未顯示出來，一個視野中看到的顆粒過少，如圖5（a）所示。染色時間過長，染液沉積過厚，碳支持膜多處破裂，可供觀察區域也少，且碳膜破裂引起碳膜卷曲，引起顆粒變形，影響觀察的真實性，如圖5（c）所示。同時，過厚的染液沉積也會模糊顆粒邊界，使圖片不清晰。適當的染色時間，才能獲得合適的染色區域，得到襯度明顯，輪廓清晰的電鏡圖片，如圖5（b）所示。