稀土釹摻雜介孔生物玻璃的微球調控實驗

劉 雨， 張 英

（1.蘇州大學a.紡織與服裝工程學院；b.材料與化學化工學部，江蘇蘇州 215123；2.現代絲綢國家工程實驗室，江蘇蘇州 215123；3.南通家紡產業技術研究院有限公司，江蘇南通 226000）

0 引 言

藥物的控制釋放有利于提高藥物療效，減少用藥次數，是生物醫用材料領域的研究熱點之一［1-3］。與傳統的生物玻璃材料相比，介孔生物活性玻璃微球（Mesoporous Bioactive Glass Nanospheres，MBG）具有規整有序的孔道，較高的比表面積，良好的生物活性，在藥物傳輸方面受到廣泛關注［4-5］。我國稀土資源豐富，儲量居世界之首。稀土是鑭系元素的通俗名稱，元素包括鑭、鈰、釹等17 種元素［6］。稀土具有獨特的理化性質，在工業及科技領域有廣泛應用［7］。在稀土元素中，釹（Nd）元素化學性質較活潑，越來越引起人們的關注。在鎂或鋁合金中添加少量Nd，可提高合金的耐高溫性能和氣密性［8］；摻雜Nd 的激光器可代替手術刀用于摘除手術或消毒傷口［9］；農藥中適量的Nd元素能促進作物的生長，提高農作物的抗病性［10］。釹鐵硼（NdFeB）磁能積高，被稱作當代“永磁之王”，以其優異的性能廣泛用于電子行業［11-12］。但將Nd 用于MBG的研究尚且比較有限，本實驗采用溶膠-凝膠法制備Nd 摻雜介孔生物玻璃（Nd/MBG），研究不同Nd摻雜比對Nd/MBG微球藥物控制釋放能力及其生物安全性的影響，探討其在藥物載體領域的應用潛力。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、乙酸乙酯（EA）、正硅酸乙酯（TEOS）、磷酸三乙酯（TEP）、四水硝酸鈣（CN）、無水乙醇（EtOH）、氨水（NH3·H2O）、胰酶、高糖培養基（DMEM）、胎牛血清（FBS）。

1.2 樣品制備

取1.2 g的CTAB加入EtOH和NH3·H2O中，攪拌溶解后依次加入TEOS、TEP 及不同量的CN 和Nd2O3。反復離心沖洗，60 ℃干燥24 h，650 ℃空氣下煅燒3 h，得不同Nd摻雜比的Nd/MBG微球（表1）。

表1 Nd/MBG微球樣品的主要成分

1.3 形貌表征

Nd/MBG微球的形貌結構用冷場掃描電子顯微鏡（SEM，S-4700，日本）和透射電子顯微鏡（TEM，FEI Tecnai G-20，美國）表征。表面元素、基團變化用X 射線光電子能譜（XPS，XSAM800，美國）及傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，Nicolet iS5，美國）進行分析。比表面積、孔徑分布和吸-脫附等溫曲線用比表面測定儀（BET，ASAP2020（M ＋C），美國）表征。

1.4 礦化能力

稱取0.05 g 的Nd/MBG 微球浸泡于50 mL 的模擬生理體液（SBF）［13］，37 ℃恒溫水浴震蕩3 d，丙酮沖洗并干燥，SEM 與FTIR 分析Nd/MBG 表面羥基磷灰石（HA）的礦化能力。

1.5 藥物裝載

避光條件下，將50 mg Nd/MBG 微球加入到配置好的DOX 溶液中（0.25 mg/mL，6 mL），震蕩24 h 后離心收集上清液，得到裝載DOX 的Nd/MBG-DOX 微球。紫外可見分光光度計（UV-Vis，CARY50，美國）測定在480 nm吸光度值，計算DOX的裝載率：

式中：Wi為DOX的初始量；Wr為未裝載DOX的量。

1.6 藥物釋放

將Nd/MBG-DOX浸泡于7 mL 不同pH 值（pH ＝4.3、7.4、8.6）的PBS 溶液中，恒溫水浴震蕩，一定時間點取3.5 mL PBS 溶液，UV-Vis 測定吸光度，計算DOX的累積釋放量：

式中：Ct為對應時間的DOX 濃度；v 為介質體積3.5 mL；V為體系總體積7 mL。

1.7 細胞毒性

取濃度為1 × 105個/mL的人骨肉瘤細胞（MG63）種植到96 孔板中，加入不同濃度（50、100、200 μg/mL）的Nd/MBG 微球及Nd/MBG-DOX 微球。培養1，3，5 d，CCK-8 試劑盒（CCK-8，Sigma，St.Louis，USA）檢測細胞活力［19］，不加材料組為空白對照組。

2 結果與討論

2.1 Nd/MBG微球的表面形貌表征

從圖1（a）TEM 可看出，Nd/MBG 微球為均勻的球形，粒徑達到納米級，表面存在微小的納米孔隙。不同Nd摻雜量的Nd/MBG微球材料從內到外逐漸變得疏松。EDS 圖顯示微球中Si、P 和Ca 元素呈均勻分布，Nd 在MBG 中呈現高度分散的均勻分布（圖1（b））。XPS結果顯示，0 Nd/MBG微球中存在Si特征峰，未見Nd特征峰。摻雜Nd后的Nd/MBG微球中Si元素圖形與未摻雜時相似，但元素的結合能變小，電子數變少，價態升高，表明此時的Si 以四價的形式存在的。Nd元素圖譜中，980 和1 000 eV 處出現明顯的3d 5/2和3d 3/2 的結合能譜峰，表明Nd3＋的存在（見圖1（c））。

圖1 （a）不同Nd摻雜比的Nd/MBG微球的TEM圖；（b）EDS能譜分析1 Nd/MBG微球表面Si、Ca、P和Nd元素分布；（c）0、2 Nd/MBG微球表面Si4 ＋、Nd3 ＋的XPS圖譜

吸脫附等溫線的形狀與材料的結構有關［15］，利用N2吸附-脫附測試檢測Nd/MBG微球的孔徑及結構變化（見圖2）。不同Nd摻雜比的Nd/MBG微球的洗脫等溫線均為Langmuir IV型等溫線，具有H1 型遲滯回線，表明Nd/MBG微球具有介孔結構。通過BET方程計算，0 Nd/MBG的比表面積（SBET）、平均孔徑（DP）和孔體積（VP）分別是400 cm2/g、2.7 nm和0.33 cm3/g，隨著Nd摻雜量的增加，微球的SBET略有所減小，但DP略有所增加；1 Nd/MBG 的DP最高到4.5 nm；2 Nd /MBG的SBET、DP和VP分別為177 cm2/g、3.6 nm 和0.22 cm3/g。表明改變Nd 的摻雜量，可以調節Nd /MBG微球的大小及孔徑。

圖2 Nd/MBG微球的N2 吸附-脫附等溫線及孔徑分布曲線

2.2 Nd/MBG微球體外生物活性

將不同Nd 摻雜比的Nd/MBG 微球浸泡入SBF中，3 d后SEM和FTIR觀察微球表面HA的沉積情況（見圖3），考察Nd/MBG微球體外生物活性。結果表明，所有Nd/MBG 微球未浸泡SBF 前，均表現出規則的球形形態，分散均勻，表面存在介孔結構。浸泡3 d后，各組Nd/MBG微球表面均有大量HA 生成。其中0 Nd/MBG微球表面HA 呈無規則的薄片狀，摻雜Nd的Nd/MBG微球表面HA 分布更均勻，且呈三維立體花簇狀。FTIR結果顯示，0 d 時，Nd 摻雜前后的Nd /MBG微球主要特征峰無明顯變化，表明Nd 的添加不會對MBG的組成和結構造成明顯影響。浸泡3 d后，樣品在507 cm－1處出現了明顯的強峰，對應HA 中的P—O—基團的特征峰，表明Nd/MBG 微球表面有HA生成，具有生物活性。

圖3 在SBF中浸泡0和3 d后Nd/MBG微球SEM和FTIR譜圖

2.3 藥物的裝載釋放

阿霉素（Doxorubicin，DOX）是一種蒽環類廣譜抗腫瘤藥物，具有明顯的抑癌作用。但DOX難溶于水且不具有靶向性，體內易被P-糖蛋白外排。如果大量使用藥物，可能會引起不良反應［16-17］。實驗采用Nd /MBG微球裝載DOX，24 h后0 Nd/MBG微球的裝載率為86.3%，表明Nd/MBG微球能在短時間內與溶液中的DOX充分接觸吸附。增加Nd的摻雜量，DOX裝載效率略有所下降，但仍保持在70%左右。表明Nd /MBG微球有良好吸附能力，有利于提高DOX 給藥效率，減少因藥物過量使用而引起的不良反應（見表4）。

裝載DOX的Nd/MBG-DOX微球的釋放行為會受到釋放環境的影響。不同pH 條件下，Nd/MBG-DOX微球顯現出不同的控制釋放能力。pH ＝8.6 時，Nd /MBG-DOX微球的最大釋放率為36%，最小釋放率為13%（見圖5（c））；pH ＝7.4 時，最大釋放率為39%，最小釋放率為15%（見圖5（b））；pH ＝4.7 時，最大釋放率高達82%，最小釋放率為53%（見圖5（a））。相同pH條件下，不同Nd 摻雜比的Nd/MBG-DOX 微球DOX累計釋放率不同。pH ＝8.6 時，0 Nd/MBG-DOX微球在25 h內釋放率達到30%，250 h后到40%。摻雜Nd后釋放率降低，其中1 Nd/MBG-DOX 微球累計釋放量最低，250 h 后為15%（見圖5（c））。pH ＝4.3時，各組摻雜Nd的Nd/MBG-DOX微球在最初25 h內都能快速釋放DOX，并隨著時間延長顯示出良好的控制釋放能力。250 h 后，0.5，1，2 Nd/MBG-DOX 累計釋放率分別達為70%、60% 和58%（見圖5（a））。Higuchi模型計算Nd/MBG-DOX 微球的DOX 累計釋放量。相同Nd摻雜比的Nd/MBG-DOX微球，DOX在不同pH環境中的釋放量順序為pH ＝4.3 ＞pH ＝7.4＞pH ＝8.6。相同pH 條件下，DOX 動力學釋放速度順序有所不同。pH ＝8.6 時，0 Nd/MBG-DOX ＞0.5 Nd/MBG-DOX ＞2 Nd/MBG-DOX ＞1 Nd/MBG-DOX；pH ＝7.4 時，0 Nd/MBG-DOX ＞2 Nd/MBG-DOX ＞1 Nd/MBG-DOX ＞0.5 Nd/MBG-DOX；pH ＝3.4 時，0 Nd/MBG-DOX ＞1 Nd/MBG-DOX ＞0.5 Nd/MBG-DOX＞2 Nd/MBG-DOX。表明Nd/MBG-DOX 微球在不同pH值下具有差異化的延遲釋放能力，在遞送過程中有利于DOX在腫瘤部位的積累，減少耐藥現象的發生。

圖4 Nd/MBG微球裝載DOX的效率

圖5 Nd/MBG-DOX 微球在不同pH 溶液中DOX 的累計釋放曲線及Higuchi釋放模型

2.4 細胞活力

采用CCK-8 試劑盒檢測不同濃度的Nd/MBG 和Nd/MBG-DOX微球對MG63 細胞生長的影響。當濃度50 μg/mL，1 d 時各Nd/MBG 微球組的OD 值基本與control組持平，表明Nd/MBG微球能夠支持細胞生長。Nd/MBG-DOX組OD值略小于Nd/MBG組，表明Nd/MBG-DOX微球能夠釋放DOX，影響MG63 細胞的生長。3 d時，各Nd/MBG微球組的OD值較第1 d都有所上升，表明該濃度下細胞生長良好。而Nd/MBGDOX組OD 值低于各Nd/MBG 組，且存在顯著性差異。5 d時，Nd/MBG微球組生長趨勢與前3 天類似，說明該濃度下Nd/MBG 微球能夠支持MG63 細胞生長，細胞毒性小。Nd/MBG-DOX 微球能釋放DOX，明顯抑制MG63 細胞的增殖（見圖6（a））。當濃度為100 μg/mL 時，在培養初期，各Nd/MBG 組對細胞的增殖沒有產生明顯的影響，表明該濃度下Nd/MBG 微球仍能夠支持MG63 細胞生長，細胞毒性較小。Nd /MBG-DOX組細胞生長趨勢也與濃度50 μg/mL 時相似，說明Nd/MBG-DOX微球釋放的DOX能抑制MG63細胞的增殖。隨著培養時間的延長，1 Nd/MBG 微球在第5 d時表現出抑制細胞增殖的情況（見圖6（b））。當濃度增加為200 μg/mL 時，Nd/MBG 微球組的OD值較control組明顯降低，表明濃度過高的Nd/MBG微球有細胞毒性，不利于細胞生長。5 d 時，各Nd/MBG微球組的OD值較第1 d 略有所上升，但細胞毒性明顯。相同條件下，Nd/MBG-DOX 微球能夠釋放DOX，顯著抑制MG63 細胞生長（見圖6（c））。研究結果顯示當濃度低于100 μg/mL 時，Nd/MBG 微球相對無毒性，是比較安全的載體。Nd/MBG-DOX 微球能夠緩慢控制藥物釋放，起到抑制癌細胞生長的作用。

圖6 不同濃度的Nd/MBG 微球和Nd/MBG-DOX 微球對MG63細胞活力的影響（1：空白對照樣；2：0Nd/MBG；3：0.5Nd/MBG；4：1Nd/MBG；5：2Nd/MBG；6：0Nd/MBGDOX；7：0.5Nd/MBG-DOX；8：1Nd/MBG-DOX；9：2Nd/MBG-DOX）（a）：50 μg/mL，（b）：100 μg/mL，（c）：200 μg/mL（*：P ＜0.05，**：P ＜0.01）

3 結 語

本實驗采用溶膠-凝膠法制備不同Nd 摻雜比的Nd/MBG微球，大小均勻，表面存在微小的納米孔隙。通過改變Nd 摻雜比，可以調控Nd/MBG 微球的表面形貌特征。其中，1 Nd/MBG 微球具有更大的比表面積、平均孔徑和孔體積。Nd/MBG 微球能夠體外礦化生成HA，具有生物活性。Nd/MBG 微球能夠裝載DOX，且在不同pH 環境下表現出差異化的延遲釋放能力。相同Nd摻雜比的Nd/MBG-DOX微球，在pH ＝4.3 環境中的累積釋放量最大。不同Nd 摻雜比的微球，pH ＝3.4 時，2 Nd/MBG-DOX 的延遲釋放能力最強。體外細胞培養結果顯示，Nd/MBG 微球對MG63骨肉瘤細胞的生物安全性具有劑量依賴性。當濃度低于100 μg/mL 時，細胞培養時表現出較高的安全性。Nd/MBG-DOX微球能夠控制DOX 的釋放，在遞送過程中有利于DOX在腫瘤部位的積累，減少耐藥現象的發生。研究結果表明，通過改變Nd 摻雜比調控制備的Nd/MBG微球，具有良好的藥物控釋能力和生物安全性，在藥物載體領域具有潛在應用價值。