實時熒光定量PCR在EB病毒DNA檢測中的應用

符秋娟 符小芳

【摘要】目的：研究實時熒光定量PCR在EB病毒DNA檢測中的臨床效果。方法：選擇我院2019年5月至2021年6月間的191例感染患者作為研究對象，實時熒光定量PCR對191例已確診感染EBV的患者進行檢驗，對EBV-DNA外周血實施檢驗，包括白細胞（WBC）、超敏C反應蛋白（hs-CRP）、谷丙轉氨酶（ALT）、肌酸激酶（CK）、谷草轉氨酶（AST）等指標進行檢驗，并選擇200例健康人群對以上各指標進行檢驗。結果：感染組的各項相關指標較之正常人群對比差異明顯，P<0.05，差異具有統計學意義;且EBV-DNA的陽性檢出率顯著高于正常人群，P<0.05，差異具有統計學意義。結論：EB感染者的臨床表現較為復雜，經過檢驗EBV-DNA指標可進行前期診斷與評估，值得臨床借鑒和推廣。

【關鍵詞】實時熒光定量PCR;EB病毒;EB-DNA;陽性檢出率

【中圖分類號】R446.5 【文獻標識碼】A 【DOI】

Application of real-time fluorescent quantitative PCR in detection of Epstein Barr virus DNA

Fu qiujuan， Fu Xiaofang

（Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang， Guangdong 524000）

【Abstract】Objective： To study the clinical effect of real-time fluorescent quantitative PCR in detection of EB virus DNA. Methods： 191 patients with EBV infection in our hospital from May 2019 to June 2021 were selected as the research objects. Real time fluorescent quantitative PCR was used to test 191 patients with EBV infection， and the peripheral blood of EBV-DNA was tested， including white blood cell （WBC）， high sensitivity C-reactive protein （hs CRP）， alanine aminotransferase （ALT）， creatine kinase （CK）， creatine kinase （CRP）， and the expression of serum creatine kinase （CK） Aspartate aminotransferase （AST） and other indicators were tested， and 200 healthy people were selected to test the above indicators. Results： compared with the normal population， the related indexes of the infection group were significantly different （P<0.05）; And the positive detection rate of EBV-DNA was significantly higher than that of normal people， P< 0.05， the difference was statistically significant. Conclusion： the clinical manifestations of patients with EB infection are complex. EBV-DNA can be used for early diagnosis and evaluation， which is worthy of clinical reference and promotion.

【Key words】real time fluorescent quantitative PCR; Epstein Barr virus; EB-DNA;Positive detection rate

EB病毒（EBV）也被稱為人類皰疹病毒4型，在兒童時期極易引發感染，并且包括慢性活動性EBV感染、淋巴瘤等多種不良預后。該病毒在人群中分布廣泛，經過相關研究顯示，在我國3～5歲兒童群體中，EBVVCA-IgG的抗體陽性率極高，幼兒被感染后無顯著癥狀，僅會導致咽炎和上呼吸道感染等。青年群體的原發感染，將近一半的可能性發生傳染性單核細胞增多癥。該病毒主要傳播途徑為唾液，也會經血液傳播。EBV多數在口咽部的上皮細胞進行增殖，影響B淋巴細胞，將會經過血液循環導致全身性感染，可在淋巴組織中長時間存在，當人體的抵抗力降低時，EBV活化導致感染出現，包括單核細胞增多癥、淋巴瘤等疾病[1-2]。因此，本文將研究實時熒光定量PCR在EBV中的應用效果，從而對臨床診斷提供新思路，現對結果進行闡述。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇我院2019年5月至2021年6月間的191例感染患者作為研究對象，年齡2～11歲，其中男性115例，女性76例，所有患者中普通感染92例，傳染性單核細胞增多癥99例為感染組，另選擇200正常人群為健康組。兩組研究對象的各項基本資料對比無顯著差異，無統計學意義，存在可比性，P>0.05。

1.2 方法

獲取EDTA-K2抗凝血3mL，選擇TaqMan熒光探針基因擴增技術實施檢驗，選擇上海宏石SLAN-96S實施熒光定量PCR儀，50℃2min、95℃3smin，95℃10s、60℃1min、40個循環。使用貝克曼全套儀器和試劑盒對ALT、AST、CK、CK-MB進行檢驗。使用全自動細胞計數儀對WBC、異常淋巴細胞、hs-CRP進行檢驗。

1.3 統計學處理

將本次研究所得所有項目數據資料均納入SPSS21.0軟件分析，t檢驗與X 2檢驗，P<0.05可認為有統計學意義，P<0.01有非常顯著性的差異。

2 結果

經過檢驗后得知，感染組的各項實驗室指標均高于健康組，P<0.05，hs-CRP兩組對比差異不明顯，詳見表1。

3 討論

EBV在臨床中是小兒感染性疾病的主要病原，是導致各類惡性腫瘤的關鍵因素。當發生感染時，絕大部分為陰性感染，在臨床診斷中極易發生漏診和誤診的情況。經過相關資料顯示，EBV針對小兒具有較高的影響，明確其臨床特點是干預治療的關鍵所在。結合本研究結果，對3500例患者實施分析發現，傳染性單核細胞增多癥的臨床特征較為復雜，主要以發熱、淋巴結腫大為主。證明了傳染性單核細胞增多癥為主的疾病中癥狀和體征數量較多，且病情均不相同，在傳統的檢驗當中，多應用ELISA法進行診斷，但是因為該病毒多發于小兒，使得陽性率普遍偏高[3]。結合我院接納的患兒分析，傳染性單核細胞增多癥和上呼吸道感染的數量最多，側面說明了EBV所引發的疾病類型復雜，數量眾多，在診斷過程中需要進行甄別，降低漏診誤診的發生，有利于提升治療效果。因此，針對EBV患者來說，因為其體征和癥狀復雜，會導致各類疾病的發生，嚴重威脅了患者的生命健康，故早期準確快速的診斷對其具有重要意義[4]。因為該疾病的潛伏期較長，經過感染后無顯著特異性，在傳統的酶聯免疫吸附法中，無法反饋病原體的感染情況，因此在臨床應用中具有較高的局限性，并且因為部分患者的機體抵抗力低下，使得檢出率并不理想，所以酶聯免疫吸附不適合該疾病的前期診斷和評估，反之熒光定量PCR技術可利用探針釋放熒光基團，在病毒檢測中，表現出了高敏感性以及特異度，適用于病毒感染的前期診斷。

實時熒光定量PCR作為一項新型的檢驗措施，因為操作便捷、具有較高的靈敏度、強特異性等優勢在臨床中得到了廣泛的應用，并且也是最關鍵的檢驗方式，可將1個試管內的目的基因擴大至十萬或百萬倍，更利于結果的觀察，并且因為易自動化，可重復操作，在各類疾病診斷中得到了廣泛應用。當下，在分子診斷方面通過對細胞中DNA、RNA的測定，能明確病原體的數量，還能反饋出多基因遺傳病的mRAN表達量。并且有研究建議，利用實時熒光定量聯合ELISA進行檢驗。經過相關研究發現，在乙肝病毒的檢驗和診斷中，實時熒光定量PCR技術能區分病毒的類型，具有較高的靈敏度，廣泛的檢測范圍。該方式較之免疫學檢驗具有較高的準確性，并且可直接反饋病原微生物的情況。總結近年來的相關研究發現，熒光定量PCR技術的診斷效能已經被得到證實。當發生EBV感染后，機體將會表現出急性或亞急性全身性疾病，病變涉及涵蓋了心、肺、腎、血液、淋巴結等。因為個體的疾病程度不同，所以臨床表現也存在區別。經過本研究結果顯示，研究對象的ALT、AST、CK以及CK-MB水平均會隨著EBV-DNA拷貝數量的增加而變化。應用熒光定量PCR對EBV-DNA拷貝數量實施檢驗，可評估患者的疾病情況，在疾病監控方面具有較高的應用價值。總體來說，EBV感染后主要導致呼吸道疾病，同時發病年齡大多集中在3～8歲兒童，主要和生活環境具有一定聯系，在診斷過程中，也應當考慮是否為集體感染的可能性[5]。因此前期診斷和治療對EBV具有重要意義。結合本研究結果進行分析，實時熒光定量PCR技術對EBV-DNA進行檢驗，有利于EBV感染的診斷，對EBV-DNA拷貝數進行分析，可明確病毒在機體內的復制情況，可用于疾病判斷，針對該病毒導致的其他感染或器官損傷的預防中具有重要意義[6]。在相關研究資料中顯示，EBV-DNA水平和肝功能損傷表現正相關，當下普遍認為病理機制是EBV通過增殖復制，對細胞免疫起到了激活的作用，進而一步對機體的淋巴組織和淋巴器官進行影響，異常的淋巴細胞侵襲中央靜脈鄰近和肝小葉，特別是距離中央靜脈越近，肝小葉的分布越密集，最終導致干細胞損傷。需要注意的是，傳染性單核細胞增多癥為自限性，預后較為理想[7-8]。綜合本研究結果可以得出，實時熒光定量PCR技術在臨床中應用廣泛，在各個疾病檢測中均有使用，因為該方式能為臨床診斷提供可靠有效的根據，進而一步協助醫生發現病毒感染的特征，而且，經過相關研究顯示，從檢測樣本到獲取結果，僅僅需要兩個小時，針對小兒不明原因發熱，咽炎等疾病具有較高的臨床診斷意義。

總體來說，實時熒光定量PCR技術第EBV-DNA進行檢驗，有利于前期診斷和相關治療方案的制定，并且能有效評估疾病的發展情況，經過本研究分析得知，EBV感染者的樣本獲取時間和EBV-DNA拷貝數存在密切聯系，實時熒光定量PCR技術對EB病毒的診斷具有較高的應用價值，值得臨床研究和借鑒。

參考文獻：

[1]吳曉利.實時熒光定量PCR與PCR-ELISA在乙型肝炎病毒DNA定量檢測中的應用比較[J].生物化工，2021，7（03）：97-98+101.

[2]馬晶晶，孟雨.實時熒光定量PCR檢測HBV-DNA與化學發光磁微粒法檢測乙肝五項的關系[J].基層醫學論壇，2021，25（07）：970-972.

[3]彭萍，何力志，彭鑫，張裕，焦芳艷.3個不同國產乙肝病毒DNA實時熒光定量PCR檢測試劑盒檢測結果的比較[J].質量安全與檢驗檢測，2020，30（06）：54-56+60.

[4]姜英，雷清，張巧玲，陳繼軍，楊俊杰.諾如病毒基因工程疫苗中殘余宿主DNA實時熒光定量PCR檢測方法的建立及驗證[J].中國生物制品學雜志，2020，33（12）：1426-1430.

[5]孟歡，郭杰，遲小偉，潘美晨，殷商啟，何超男，王雅杰.利用實時熒光定量PCR系統檢測人巨細胞病毒DNA性能驗證探討[J].標記免疫分析與臨床，2020，27（10）：1781-1784.

[6]姜趙華，肖勇武.對比實時熒光定量PCR檢測TB-DNA與痰涂片在肺結核診斷中的應用[J].醫學食療與健康，2020，18（15）：180+183.

[7]宋予娟，耿嵐，王華，等.實時熒光定量PCR法檢測EB病毒DNA在兒童EB病毒感染中的應用[J].醫學檢驗與臨床，2018，29（4）：18-20.

[8]許良云，張其剛，范廣來，等.人微小病毒B19熒光定量聚合酶鏈式反應檢測方法的建立[J].實用臨床醫藥雜志，2021，25（7）：11-14，20.