多穗柯總黃酮對db/db小鼠胰高血糖素樣肽-1分泌的影響

陳敬民　李燕婧

摘要：目的 探討多穗柯總黃酮對db/db小鼠腸道胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）分泌的影響。方法 選取db/db雄性小鼠按空腹血糖值隨機分組，多穗柯總黃酮以100、200 mg/kg劑量灌胃給藥4 w，進行糖負荷GLP-1分泌實驗，然后處死動物，取回腸組織，免疫熒光法檢測分泌GLP-1的細胞情況，測量食耗量、飲水量、空腹血糖值、血清GLP-1及分泌GLP-1細胞比例。結果 多穗柯總黃酮100或200 mg/kg劑量組均能顯著減少db/db小鼠周食耗量（P<0.05或P<0.01）、周飲水量（P<0.01）;降低空腹血糖值（P<0.05或P<0.01）;顯著升高空腹GLP-1水平（P<0.01）。多穗柯總黃酮200 mg/kg劑量組能顯著升高糖負荷后30、60 min的血清GLP-1水平（P<0.05）;增加分泌GLP-1的細胞比例（P<0.01）。結論 多穗柯總黃酮通過減少腸道L細胞損傷，保護其分泌GLP-1的功能，增加GLP-1的分泌，發揮防治糖尿病作用。

關鍵詞：多穗柯總黃酮;糖尿病;胰高血糖素樣肽-1

中圖分類號：R285.5?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2021）10-0079-04

胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）是腸道Langerhans細胞分泌的腸肽類激素，GLP-1能再生和修復胰島β細胞，增加β細胞數量并抑制其凋亡，提高β細胞質量和數量，改善β細胞功能[1]。通過提高體內GLP-1水平改善胰島β細胞功能，進而提高胰島素分泌水平，從而達到防治糖尿病的目的，是藥物治療糖尿病重要作用機制之一。

多穗柯是殼斗科植物木姜葉柯Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun.的干燥嫩葉，富含以根皮苷（Phlorizio-1），三葉苷（Trilobation-2），3-羥基根皮苷（3-hydroxy phlorizin-3）為主的黃酮類物質[2，3]，具有潤肺鎮咳、滋潤肝腎、清熱利尿等效用，系廣西瑤族地區常用于降血糖的民間草藥。本課題組人員曾研究發現其在治療糖尿病方面有顯著的藥理作用[4]，本實驗利用db/db小鼠糖尿病模型，在考察糖負荷GLP-1變化基礎上，結合免疫熒光技術，探討多穗柯總黃酮防治糖尿病的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級C57、db/db小鼠，雄性，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2016-0010，飼養于廣西中醫藥研究院動物房，實驗動物使用許可證號：SYXK桂2016-0006，飼養溫度（22±2）℃，環境相對濕度（50±5）%，無菌水，標準鼠料，12小時自由進食/12小時禁食，自由飲水。本實驗遵守國家有關實驗動物保護與使用準則。

1.2 藥物與試劑 多穗柯來源于廣西百色，經廣西中醫藥研究院饒偉源主任中藥師鑒定為殼斗科植物木姜葉柯Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun.的干燥嫩葉;鹽酸二甲雙胍片（批號：190610），北京京豐制藥集團有限公司;卓越金采血糖試紙，羅氏血糖健康醫護公司;4%多聚甲醛，北京博奧拓達科技有限公司;小鼠胰高血素樣肽-1（GLP-1）酶聯免疫檢測試劑盒，上海仁捷生物科技有限公司;Anti-GLP-1 Rabbit pAb抗體，Cy3標記山羊抗小鼠IgG（紅色），細胞核染色劑DAPI，均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 卓越精采血糖儀（羅氏血糖健康醫護公司）;Thermo 1510酶標儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）;Eclipse Ci-L正置熒光拍照顯微鏡（日本Nikon公司）;Image-pro Plus 6.0圖片分析軟件（美國Media Cybemetics公司）。

1.4 統計學方法 用SPSS19.0軟件進行統計分析，數據以（x[TX-*3/8]±s）表示，采用單因素方差分析，組間進行LSD檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 方法

2.1 多穗柯總黃酮的制備 多穗柯藥材粉碎，70%乙醇溶液以10：1液藥比回流提取2次，每次2 h，提取液濾過，濃縮成稠膏，用溫蒸餾水稀釋，上大孔樹脂，水、乙醇梯度洗脫，收集50%醇洗脫部分，濃縮，冷凍干燥成粉未，284 nm處檢測總黃酮含量為89%。

2.2 實驗分組與給藥[5] 動物適應性飼養3 d，C57小鼠為正常對照組，db/db小鼠尾靜脈針刺取血，血糖儀測空腹血糖值，按血糖值隨機分為模型組、二甲雙胍83 mg/kg組、多穗柯總黃酮100和200 mg/kg組，每組8只，每籠2只分籠飼養。各給藥組灌胃給藥，給藥體積為20 mL/kg，連續28 d，正常對照組及模型組給予蒸餾水，每周均測量各鼠空腹血糖、食耗量及飲水量。

2.3 糖負荷GLP-1分泌實驗[6-7] 末次給藥前尾靜脈取血，給藥1 h后進行實驗，各鼠分別按1 g/kg灌胃給予10%葡萄糖溶液，并于口服葡萄糖后30、60、120 min尾靜脈取血，血液3000 r/min離心10 min，分離血清，測量小鼠血清GLP-1含量，計算各組小鼠血清GLP-1的均數方差。

2.4 腸組織分泌GLP-1的L細胞檢測[8-10] 實驗結束后禁食12 h，脫頸椎處死小鼠，冰臺上清理脂肪，迅速取回腸組織，4℃生理鹽水清洗腸道，置4%多聚甲醛固定24 h，進行修剪、脫水、包埋、切片、脫蠟、抗原修復、一抗孵育、二抗覆蓋、DAPI復染，淬滅封片，熒光拍照顯微鏡下檢查，每張切片選取3個目的區域200倍成像，拍攝GLP-1及DAPI熒光照片，使用圖片分析軟件分析回腸組織分泌GLP-1的L細胞及其他細胞數，計算分泌GLP-1的L細胞百分率。

L細胞百分率=回腸GLP-1染色區域面積/（GLP-1及DAPI染色區域面積總和）×100%

3 結果

3.1 對db/db小鼠食耗量和飲水量的影響 結果如表1、表2所示，與正常對照組比較，模型組小鼠周食耗量、周飲水量隨時間進行性顯著增多（P<0.01）。與模型組比較，多穗柯總黃酮100、200 mg/kg組的周食耗量、周飲水量顯著減少（P<0.05或P<0.01）。

3.2 對db/db小鼠空腹血糖的影響 結果如表3所示，與正常對照組比較，模型組小鼠空腹血糖隨時間進行性顯著增高（P<0.01）。與模型組比較，多穗柯總黃酮以100 mg/kg給藥7、14 d或以200 mg/kg給藥均顯著降低空腹血糖（P<0.05或P<0.01）。

3.3 對db/db小鼠血清胰高血糖素樣肽1（GLP-1）的影響 結果如表4所示，與正常對照組比較，模型小鼠空腹、口服葡萄糖后血清GLP-1含量明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，多穗柯總黃酮100、200 mg/kg連續給藥28 d顯著升高空腹血清GLP-1含量（P<0.01），多穗柯總黃酮200 mg/kg連續給藥28 d能顯著升高口服葡萄糖后0.5、1.0 h的血清GLP-1含量（P<0.05）。

3.4 對db/db小鼠分泌GLP-1細胞的影響 結果如表5所示，與正常對照組比較，模型組小鼠回腸分泌GLP-1的L細胞數明顯減少，腸組織細胞中的比例顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，多穗柯總黃酮200 mg/kg連續給藥28 d明顯增加回腸分泌GLP-1的L細胞數，腸組織細胞中的比例顯著增加（P<0.01）。腸組織免疫熒光檢查結果如圖1所示，正常對照組腸組織分泌GLP-1的L細胞層連續光滑、致密，模型組小鼠腸組織分泌GLP-1的L細胞層斷續、離散，多穗柯總黃酮100、200 mg/kg連續給藥28 d能使db/db小鼠分泌GLP-1細胞層形態連續性、致密度明顯優于模型組。

4 討論

db/db小鼠是C57小鼠4號染色體瘦素受體基因定向敲除引起的一種自發性2型糖尿病模型小鼠，具有和人類2型糖尿病相似的臨床癥狀，有多飲、多食、多尿、肥胖、高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗等特征，是理想2型糖尿病模型[11]。與正常對照組比較，模型組食耗量、飲水量及空腹血糖值顯著增高（P<0.01）;與模型組比較，多穗柯總黃酮連續給予28 d，db/db小鼠多飲多食的糖尿病癥狀明顯改善（P<0.05或P<0.01），表明多穗柯總黃酮能較好改善db/db小鼠糖尿病癥狀的作用。

GLP-1受進食、胃腸神經等影響，糖類、脂肪營養物質刺激腸組織增加GLP-1分泌，使外周血GLP-1濃度增高，發揮“腸促胰島素”作用，并促進胰腺葡萄糖依賴性胰島素釋放，調節體內餐后葡萄糖達到穩態[12-14]。本實驗開展口服糖負荷實驗，與正常對照組比較，模型組糖后血清GLP-1含量明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，多穗柯總黃酮連續給藥28 d能顯著增加小鼠空腹及糖后血清的GLP-1含量（P<0.05）。表明多穗柯總黃酮通過提高分泌GLP-1基礎值來發揮GLP-1的降糖作用。

L細胞是腸道分泌GLP-1的內分泌細胞，2型糖尿病GLP-1分泌水平下降與腸道L細胞受損有關[15-16]。本實驗對腸組織進行GLP-1免疫熒光分析，正常對照組小鼠分泌GLP-1的L細胞層連續、光滑、致密、比例高;與正常對照組比較，模型組小鼠分泌GLP-1的L細胞層斷續、疏散、比例低（P<0.01）;與模型組比較，多穗柯總黃酮連續給藥28 d后，db/db小鼠分泌GLP-1的L細胞連續性較好、比例明顯增多（P<0.01）。表明多穗柯總黃酮能提高L細胞分泌GLP-1的能力，減少糖尿病小鼠L細胞的損傷。

綜上所述，多穗柯總黃酮能顯著改善db/db小鼠多飲多食的糖尿病癥狀，降低空腹血糖值，提高空腹或餐后血清GLP-1水平，減少分泌GLP-1的腸組織L細胞的損傷，表明多穗柯總黃酮通過減少腸道L細胞損傷，保護其分泌GLP-1的功能，增加GLP-1的分泌，發揮多穗柯總黃酮防治糖尿病的作用。

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（收稿日期：2021-07-16）