豆腐渣果減輕酒精致小鼠氧化應激及炎癥損傷的活性研究

張維明　李立紀　陶劍　陳得玲　唐世朗

摘要：目的 探討傣藥豆腐渣果樹皮和果實95%乙醇提取物對酒精引起的氧化應激損傷的抗氧化應激及抗炎活性。方法 采用采用56度北京紅星二鍋頭白酒，以0.05mL/10 g.d給KM種小鼠連續灌胃4周，于模型復制的第2周開始，動物在造模的同時分別給予豆腐渣果樹皮和果實95%乙醇提取物，連續給予3周，末次給藥后，處死動物，檢測動物血清中MDA、SOD、TNF-α的含量及腦勻漿中MDA、SOD的含量。結果 與正常組比較，模型組小鼠給予白酒后第4周即出現血清和腦組織中SOD水平明顯下降（P<0.01），MDA水平明顯升高（P<0.01），血清中炎癥因子TNF-α水平明顯升高（P<0.01）。與模型組相比，給予豆腐渣果樹皮和果實的醇提取物3周后，均可降低血清中MDA水平和TNF-α水平（P<0.05），并可升高血清和腦中SOD水平（P<0.05）。結論 豆腐渣果樹皮和果實的95%乙醇提取物可減輕酒精引起的氧化應激損傷及炎癥因子釋放。

關鍵詞：豆腐渣果;抗氧化;抗炎;活性研究

中圖分類號：R285.5?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1007-2349（2021）10-0075-04

【Abstract】Objective： To study the anti-oxidative stress and anti-inflammatory activities of the 95% ethanol extracts from the bark and fruit of Helicia erratica Hook in Dai medicine on alcohol-induced oxidative stress damage. Methods： 56% degree of Beijing Hongxing Erguotou Liquor were used to give KM mice intragastrically with 0.05mL/10 god for 4 consecutive weeks. Starting from the second week of model replication， the animals were given the 95% ethanol extracts from the bark and fruit of Helicia erratica Hook for 3 weeks at the same time as the model was created. After the last administration， the animals were sacrificed to detect the contents of MDA， SOD， and TNF-α in the animal serum and the contents of MDA and SOD in the brain homogenate. Results： Compared with the normal group， the SOD level in serum and brain tissue of the model group decreased significantly （P<0.01）， the MDA level increased （P<0.01）， and the serum inflammatory factor TNF-α level in the 4th week after the administration of liquor was significantly increased （P<0.01）. Compared with the model group， after 3 weeks of alcohol extracts from the bark and fruit of Helicia erratica Hook， the levels of MDA and TNF-α in the serum could be reduced （P<0.05）， and the levels of SOD in the serum and brain could be increased （P<0.05）. Conclusion： The 95% ethanol extract from the bark and fruit of Helicia erratica Hook can reduce the oxidative stress damage and the release of inflammatory factors caused by alcohol.

【Key words】Helicia erratica Hook; Antioxidant; Anti-inflammation; Activity Study

酒精中毒性腦病（Alcoholic Brain Disease，ABD）是酒精中毒最常見、也是最嚴重的并發癥之一，是由于長時期大量酗酒引起人體營養代謝紊亂，導致中樞神經損害的一類疾病。肝臟是酒精代謝的主要器官，因此既往對酒精造成肝臟損傷的研究較為深入，但近年來的研究表明，過度飲酒可造成腦內炎癥甚至是不可逆性腦組織損傷[1]，因此ABD的診治越來越引起人們的關注。

豆腐渣果（深綠山龍眼，Helicia nilagirica Bedd）為山龍眼科Proteaceae山龍眼屬Helicia植物，分布于云南產于云南西南部和南部（西雙版納、普洱、保山等地），是傣醫用于解除農藥中毒、食用野生菌中毒的常用民族藥。課題組前期研究發現，豆腐渣果的乙醇提取物具有一定的解酒精中毒作用，并能減輕急性腦損傷動物腦組織炎癥反應，故推測豆腐渣果可能對ABD具有潛在活性，本研究擬探討豆腐渣果不同部位的95%乙醇提取物對酒精誘導的氧化應激反應和炎癥因子釋放的影響，為研究其對抗ABD的活性提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 試劑：紅星二鍋頭（北京紅星股份有限公司，批號：19212938102）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司，批號：063016161009）;小鼠TNF-α ELISA試劑盒、小鼠SOD、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20190109）;豆腐果苷（Heli）（東京化成工業株式會社，批號：41VZE-DG）。豆腐渣果果實95%乙醇提取物（自制，提取率6%，給藥濃度7 mg/mL，相當于2.28 g生藥/kg）;豆腐渣果樹皮95%乙醇提取物（自制，提取率8%，給藥濃度9 mg/mL，相當于2.28 g生藥/kg）。

儀器：分析天平（XS125A，瑞士普利賽斯）;酶標儀（Infinite M200 PRO，瑞士Tecan公司）;低溫高速離心機（cf16RX，Hitachi Koki公司）。

1.2 實驗方法 昆明種小鼠100只，雌雄各半，體重18～22 g。隨機分成5個組，分別為：正常組，模型組，樹皮組，果實組，Heli組，每小組10只。藥物的干預方案：正常組和模型組均經口給予等體積生理鹽水，藥物經口給予相應的藥物：樹皮組（2.28 g生藥/kg）、果實組（2.28 g生藥/kg）、Heli組（40 mg/kg）。除正常組外，其余各組用56度北京紅星二鍋頭白酒，以0.05mL/10 g.d灌胃劑量灌胃1周后，于實驗第2周起，每天上午正常組灌胃生理鹽水，其它各組灌胃給予相應受試物，6 h后灌胃白酒，劑量同前，連續給藥+白酒3周，實驗過程每周稱取小鼠體重并記錄小鼠精神狀態等一般情況，于第4周時，末次給酒后1h，所有動物過量麻醉后心臟取血，3000轉/分離心20分鐘，制備血清，檢測血清中MDA、SOD、TNF-α含量，處死動物，冰上取腦，制備腦勻漿，置-80℃冰箱保存，用于檢測腦組織MDA、SOD含量。

1.3 統計學方法 數據以均數±標準差（x[TX-*3/8]±s）表示。組間比較采用單因素方差分析法，方差齊者采用LSD法檢驗，方差不齊者采用Tamhane′s法檢驗。

2 結果

2.1 豆腐渣果不同提取物對小鼠體重的影響 結果顯示，給予酒精灌胃4周，模型組動物體重明顯降低，與正常組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）;給予豆腐渣果樹皮和果實提取物后，動物體重較模型組呈上升趨勢，實驗第四周時，樹皮組和果實組動物體重明顯高于模型組，差異具有統計學意義（P<0.05）;豆腐渣果的活性成分豆腐果苷在整個給藥過程均可明顯升高動物的體重，與模型組相比差異具有統計學意義（P<0.05）詳見表1。

2.2 豆腐渣果不同提取物對小鼠血清中SOD、MDA水平的影響 結果顯示，與正常組比較，模型組血清SOD水平顯著降低（P<0.01）;與模型組相比，給予豆腐渣果的果實提取物可明顯升高血清中SOD水平（P<0.05），但樹皮提取物作用不明顯;給予豆腐果苷的作用不明顯;與正常組相比，模型組血清中MDA水平明顯升高（P<0.01），與模型組比較，給予豆腐渣果的果實提取物可明顯降低血清中MDA水平（P<0.05），但樹皮提取物作用不明顯;給予豆腐果苷的作用不明顯。詳見表2。

2.3 豆腐渣果不同提取物對小鼠腦組織中SOD、MDA水平的影響 結果顯示，與正常組比較，模型組腦組織中SOD水平顯著降低（P<0.01）;與模型組相比，給予豆腐渣果的果實提取物和樹皮提取物均可顯著升高血清中SOD水平（P<0.01或P<0.05），給予豆腐果苷也可明顯升高血清中SOD水平（P<0.05）;與正常組相比，模型組腦組織中MDA水平明顯升高（P<0.01），與模型組比較，給予豆腐渣果的果實提取物和樹皮提取物均可明顯降低血清中MDA水平（P<0.05）;給予豆腐果苷的作用不明顯。詳見表3。

2.4 豆腐渣果不同提取物對小鼠血清和腦組織中TNF-α水平的影響 結果顯示，與正常組比較，模型組血清和腦組織中TNF-α水平顯著升高（*[KG-*4]*P<0.01）;與模型組相比，給予豆腐渣果的果實提取物和樹皮提取物均可明顯降低血清和腦組織中TNF-α水平（#P<0.05）;給予豆腐果苷的作用不明顯。詳見表4。

3 討論

慢性酒精中毒性腦病是全球常見疾病，可嚴重危害人類健康。飲酒是云南少數民族表達精神生活需要的重要載體，隨著居民生活水平的逐漸提高，該病的發病率不斷提高。但長期過量飲酒不僅是導致肝損傷的主要病因，也是誘發腦血管疾病及老年癡呆的重要危險因素。目前治療慢性酒精中毒性腦病的措施包括了戒酒、解毒、病因治療、神經保護和康復治療等。戒酒是慢性酒精中毒性腦病最重要方法，但由于患者往往難以長期堅持而易造成再次酗酒的發生，苯二氮類解毒藥物治療對過度飲酒造成的癲癇發作、譫妄等癥狀具有顯著療效[2]。隨著對慢性酒精中毒性腦病研究的深入，不斷發現，該病不僅臨床表現多樣化，其分子機制也較為復雜。給臨床治療慢性酒精中毒性腦病患者帶來巨大的挑戰[3]。

云南少數民族在長期與疾病作斗爭的過程中積累了很多行之有效、簡便廉驗的方藥，傣醫解藥是其中最有代表性方藥之一。豆腐渣果是傣醫用于解酒毒、菌毒、農藥中毒的一種解藥[4]。豆腐渣果為山龍眼科山龍眼屬（Helicia）植物深綠山龍眼（Helicia nilagirica Bedd）的種子，課題組前期研究顯示豆腐渣果的活性成分豆腐果苷具有較強的抗血栓形成及降低腦組織炎癥因子TNF-α和IL-1β釋放的作用，在對豆腐渣果的醇提物進行解酒作用初步研究時發現其具有一定的解酒作用，故推測豆腐渣果可能對慢性酒精中毒性腦病有潛在的活性。為證實此假說，進行了本實驗的研究。

本實驗以豆腐渣果的果實及樹皮95%乙醇提取物作為研究對象，考察了它們對小鼠長期灌胃白酒后血清和腦組織中氧化應激指標和炎癥因子釋放的影響，同時為了明確豆腐渣果提取物的作用是否為其已知的活性成分豆腐果苷發揮，故同時對豆腐果苷的作用進行了考察。實驗結果顯示，小鼠灌胃56度的食用白酒4周后，體重明顯減輕，血清和腦組織中抗氧化因子SOD明顯降低，氧化應激產物MDA水平顯著升高，提示，長期飲酒引起了機體明顯的氧化應激損傷，同時，小鼠血清和腦組織中炎癥因子TNF-α釋放增加，表明長期飲酒引起了機體炎癥反應，同時也提示，長期飲酒造成的損傷可涉及多種病理環節。給予豆腐渣果的果實及樹皮95%乙醇提取物后，可明顯升高血清和腦組織中SOD水平，降低MDA水平，說明豆腐渣果的兩種提取物均具有抗氧化應激活性;另外，給予豆腐渣果的果實及樹皮95%乙醇提取物后，小鼠血清和腦組織中的炎癥因子TNF-α釋放減少，說明兩種提取物具有減輕酒精引起的炎癥反應。同時，本實驗的結果還提示，豆腐渣果的果實及樹皮95%乙醇提取物具有一定的阻止因過度飲酒造成的體重減輕。對豆腐渣果的已知活性成分豆腐果苷的研究結果提示，豆腐果苷可以阻止因過度飲酒造成的體重減輕，但對過度飲酒造成氧化應激損傷及炎癥反應無明顯的抑制作用。說明豆腐渣果的上述活性并非由豆腐果苷發揮，其活性成分另有它物。本實驗的結果為后期解析豆腐渣果作為傣醫解藥解“酒毒”的物質基礎及進行作用機制研究奠定了良好的基礎。

參考文獻：

[1]Obad A，Peeran A，Little JI，et al.Alcohol-Mediated Organ Damages[J].Heart and Brain，2018（9）：81.

[2]李藝，彭英.《慢性酒精中毒性腦病診治中國專家共識》解讀[J].中國現代神經疾病雜志，2019，19（1）：1-4.

[3]曾玉娥，吳曉牧，楊海玉.慢性酒精中毒性腦病的臨床與病理機制研究進展[J].中風與神經疾病雜志，2013，30（5）：475-477.

[4]彭朝忠，段立勝，李學蘭.傣族民間解毒藥物收集[J].中國民族醫藥雜志，2005，2：16-16.

（收稿日期：2021-07-16）