西尼羅河病毒感染與免疫機制研究進展

孫 靜，何 展，蔡 暢，衛芳芳，程昌勇，宋厚輝 (浙江農林大學 動物科技學院/動物醫學院 浙江省畜禽綠色生態健康養殖應用技術研究重點實驗室 中澳動物健康大數據分析聯合實驗室，浙江 杭州 311300)

西尼羅河病毒(West Nile virus,WNV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)家族成員，為分節段的單股正鏈 RNA 病毒，基因組長度約為11 kb(圖1)。該病毒的生命周期如圖2所示，首先附著于細胞表面受體(未知)，被細胞內吞后與吞噬體膜融合，釋放病毒基因組RNA進入細胞質，被翻譯為一個單一的多聚蛋白，該多聚蛋白隨后被病毒和宿主蛋白酶裂解，產生3個結構蛋白(C、prM和E)和7個非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1]。結構蛋白會包裹病毒RNA參與病毒粒子的形成，非結構蛋白形成負向和正向病毒RNA合成所需的復制復合體。病毒粒子在宿主體內完成組裝并通過宿主分泌途徑進行轉運，成熟的病毒粒子通過胞吐作用從感染細胞釋放出來，從而進行新一輪感染[2]。

圖1 WNV結構

圖2 WNV生命周期

在自然界中，WNV主要在蚊(主要是庫蚊)和鳥類之間循環傳播，但偶爾出現循環外溢，從而感染人類和一些馬屬動物。有研究顯示，WNV在一些哺乳動物(如松鼠)和爬行類動物(如鱷魚)中存在[3]。因此，目前建立的基于小鼠、倉鼠和一些非人類靈長類動物的WNV感染動物模型，為人類進一步了解其感染機制提供了研究基礎。現綜述WNV的發病機制，重點介紹先天免疫激活、先天免疫應答與適應性免疫應答之間的相互干擾以及針對病毒免疫逃逸對策等方面的最新研究進展并圍繞這些進展進行了討論，以期為新型治療方法的研制及疫苗接種期間如何提高免疫力的策略方面提供新思路。

1 WNV的發病機制

WNV可在蚊蟲的腸上皮細胞中復制，并通過血液、淋巴傳播到唾液腺和其他器官，由此可知，限制WNV傳播能力的關鍵步驟在于蚊蟲的腸道屏障，該屏障主要依賴于產生抗菌肽和圍食基質(由幾丁質、蛋白質、糖蛋白和蛋白聚糖組成)作為物理和免疫屏障，共同限制病毒在昆蟲內的復制和傳播[4-5]。WNV感染可激活無脊椎動物先天免疫系統(如Toll、JAK-STAT介導的先天免疫信號通路和抗菌肽)，從而限制其感染。另外，蚊蟲攜帶的沃爾巴克氏體細菌(一種共生細菌)，可以抑制WNV在昆蟲體內的復制。

WNV感染機體后會呈現3個不同的階段，包括初始感染和傳播(早期階段)、外周病毒擴增(內臟器官傳播階段)和神經侵襲(中樞神經系統階段)。人體一旦被感染，機體免疫系統會發揮不同程度的抗病毒作用：(1)先天免疫應答包括細胞內抗病毒防御、Ⅰ型干擾素(IFN)應答和免疫細胞介導的應答(包括中性粒細胞、自然殺傷細胞和γδT細胞)，協調WNV的早期控制；(2)適應性免疫應答包括體液和適應性免疫細胞(CD4+、CD8+和調節性T細胞)介導的應答。

在協助WNV傳播感染過程中，蚊蟲發揮了重要的作用。首先，根據蚊蟲種類的不同，每次叮咬可將多達106個噬斑形成單位(plaque forming unit，PFU)的病毒注入宿主體內。蚊子唾液中除了含有阻斷宿主免疫反應的病毒因子外，還含有抗止血、減少炎癥和改變宿主免疫的分子，導致宿主局部免疫反應失調，包括細胞因子水平的改變、局部免疫抑制，減少中性粒細胞、樹突狀細胞(DCs)和T細胞向感染原發部位的募集等。

在突破皮膚表層結構后，病毒首先感染角質細胞和皮膚原位DCs(包括真皮DCs和朗格漢斯細胞)，隨后在引流淋巴結內擴增，導致病毒血癥并擴散到脾臟等內臟器官，其中，脾臟是病毒在外周組織中復制的主要場所。截止目前，WNV在脾臟和其他外周組織感染的特異性靶細胞尚不清楚，但被認為可能與DCs、巨噬細胞的亞群，中性粒細胞有關。WNV感染的第3階段即嚴重危害感染者的中樞神經系統。其主要發病機制依賴于病毒進入中樞神經系統并在靶細胞(包括神經元和髓細胞)內的有效傳播能力。就病毒本身而言，其結構蛋白對于侵襲神經系統也有重要作用。研究顯示，WNV的E蛋白結構上的N鏈接聚糖能夠控制神經侵襲，但其具體機制尚未清楚，可能與內皮細胞的滲透有關。神經侵襲更常見的則是血腦屏障的破壞，這種變化主要由血管活性細胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)和基質活化調節的內皮細胞通透性變化觸發。其他進入中樞神經系統的機制還包括嗅覺神經元感染和一種“特洛伊木馬”機制，其主要借助被感染的免疫細胞將病毒傳遞至中樞神經系統。綜上所述，病毒能夠通過多種方式感染宿主細胞，因此，細胞的免疫防御機制顯得尤為重要[6]。

2 WNV引起的細胞內免疫應答

2.1 RLRs抗病毒機制先天性抗病毒防御對于控制WNV感染至關重要。這些防御包括Ⅰ型IFN(研究顯示IFN具有潛在的抵抗多種RNA病毒感染的能力)和促炎性細胞因子的產生，細胞內相關的抗病毒基因表達和后期細胞內適應性免疫應答反應的發生[7]。伴隨著免疫應答的發生，細胞內相關信號通路同樣被激活，病毒的病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)會被相應的宿主細胞模式識別受體(pathogen-recognition receptors,PRRs)識別，例如視黃酸(維甲酸)誘導酸誘導基因Ⅰ樣螺旋酶受體(RIG-Ⅰ-like receptors，RLRs)活化過程中的PAMPs，主要包括視黃酸誘導基因Ⅰ蛋白(retinoic-acid-inducible protein Ⅰ,RIG-Ⅰ)，黑素瘤分化抗原5(melanoma differentiation antigen 5,MDA5，亦稱IFIH1)和LPG2(亦稱DHX58)等，這些病毒模式識別受體在細胞內表達水平升高，激活下游效應子，最終導致IFN調節因子(IRF)介導的靶基因轉錄和Ⅰ型IFN的產生[8]。體外WNV感染小鼠原代細胞的研究表明，RIG-Ⅰ在感染早期很重要，而MDA5的功能是維持和放大先天免疫反應。這表明，WNV編碼的病毒PAMPs可以觸發RIG-Ⅰ和MDA5信號。在后期研究中發現，RIG-Ⅰ可以檢測正鏈和負鏈的WNV RNA，從而引起抗病毒免疫[9]。

2.2 TLRs抗病毒機制另一個關鍵的先天性免疫信號通路是由TLRs介導的。與RLRs類似，TLRs識別PAMPs，隨后激活下游信號通路，激發先天免疫防御應答。其中，TLR3可識別雙鏈RNA (dsRNA)，而TLR7和TLR8可識別GU-rich ssRNA。隨著配體的結合，TLR3募集接頭分子TRIF (TIR域內接頭誘導IFN-β)，并激活轉錄因子IRF3、IRF7和核因子κB (NF-κB)，最終引起IFN-β的轉錄和Ⅰ型IFN和促炎細胞因子的產生[10]。TLR7和TLR8可在細胞核內表達，與ssRNA結合后，招募接頭分子MYD88，激活轉錄因子IRF7和NF-κB，從而引發Ⅰ型IFNs和促炎因子的表達[11]。

2.3 Ⅰ型干擾素信號介導的抗病毒機制RLR和TLR信號都能激活IRF轉錄因子，尤其是IRF3和IRF7，它們對于調節病毒感染后的Ⅰ型IFN應答至關重要[12]。這些IRFs可誘導Ⅰ型IFN分泌，并與IFN-α和IFN-β受體復合物(IFNAR)結合，激活受體相關的激酶如酪氨酸激酶2 (TYK2)和JAK1，隨后STAT1和STAT2發生磷酸化并引起ISG因子3 (ISGF3)復合物的組裝，該復合物由STAT1-STAT2異質二聚體和IRF9組成[13]。該復合物形成后會移至細胞核并啟動IFN刺激基因(ISGs)的轉錄。此外，NF-κB激酶ε抑制劑(IKKε)可使STAT1的708位絲氨酸位點磷酸化，導致ISGF3復合物的特異性發生改變，從而增強依賴IKKε抗病毒基因的表達[14]。雖然IRF3和IRF7均可限制病毒在外周和中樞神經系統中的復制，不同細胞選擇激活的IRF也存在差異。在WNV感染的小鼠胚胎成纖維細胞和皮質神經元中，Ⅰ型IFN-α的誘導依賴于IRF3并被IRF7放大，而在DCs和巨噬細胞中，IFN轉錄僅需要IRF7[15]。而IRF3和IRF7的表達量降低并不會阻斷這些細胞中IFN-β的轉錄和ISG的表達，表明在RLR或TLR信號下游存在額外的IRFs或其他轉錄因子起協調作用，調節Ⅰ型IFN分泌[16]。

2.4 炎性小體調節免疫程序炎性小體是一種先天免疫信號復合物，可通過分泌IL-1β家族的促炎細胞因子(包括IL-1β、IL-18和IL-33)調節免疫程序并促進病毒的清除。IL-1β是一種多效細胞因子，具有雙向作用：一方面它可以通過促進免疫細胞運輸和分泌抵抗病原感染引起保護性免疫；另一方面它可以通過程序性細胞死亡，觸發病理反應。

在多種類型炎性小體中，NLRP3(含NOD、LRR和pyrin結構域蛋白3)炎性小體的激活以及隨后IL-1β家族促炎細胞因子的分泌被認為與抵抗WNV感染有關[17]。研究顯示，感染WNV的患者在發病過程中全身IL-1β水平增加，而缺乏IL-1β信號或NLRP3的小鼠更容易感染WNV[18]。感染機理為IL-1β利用朗格漢斯細胞向引流淋巴結遷移以及CD45+巨噬細胞和病毒特異性CD8+T細胞向WNV感染小鼠中樞神經系統遷移促進免疫細胞運輸到WNV感染部位[19-20]。

IL-1β與Ⅰ型IFN信號通路之間通過相互干擾控制WNV感染，當選擇性抑制IL-1β或IFN-β其一，只能抑制部分WNV的復制，而同時抑制兩者后，神經元細胞幾乎完全消除了WNV感染[21]。目前，這些途徑如何在神經元細胞內(可能存在于其他細胞類型)聚合引起細胞的抗病毒作用機理尚未清楚，目前能夠確定的是，對WNV的有效免疫反應可能依賴于IL-1β的保護功能和病理功能之間的平衡。

3 WNV的先天免疫逃避策略

隨著進化演變，WNV已經衍生出對抗先天免疫的機制。針對RLRs途徑，WNV主要通過被動逃避，掩蓋或隔離病毒RNA，使其不被RLRs所識別。這種機制使得WNV能夠順利完成病毒粒子的組裝與合成，并有助于其阻斷下游信號通路的傳導。

此外，WNV也被證實具有干擾Ⅰ型IFN表達的作用[22]。WNV非結構蛋白通過溶酶體和蛋白酶體依賴的途徑介導IFNAR1的降解；WNV逃避IFN信號轉導的其他策略包括將細胞膽固醇重新分配到病毒復制復合體的位置，從而改變膜相關信號轉導以有利于病毒的復制及非編碼亞基因組RNA的合成，后者已被確定為IFN拮抗劑[22-23]。目前已知的WNV結構與非結構蛋白(包括NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及NS5)都被報道能夠通過不同機制積極協助WNV逃逸IFIT1(IFIT1是一種ISG蛋白，被病毒感染誘導后高表達，在多條信號通路中發揮抗病毒作用)的抗病毒作用[24]。

4 WNV的免疫防控策略

目前尚沒有WNV疫苗或批準的治療方法用于人類預防或治療WNV感染。由于WNV的出現和持續傳播在世界各地造成重大的公共衛生風險，迫切需要制定干預戰略。目前，WNV的研究主要集中在確定宿主信號成分和調節免疫感染的途徑。這些研究揭示了感染細胞和組織內的調節節點，利用它們影響細胞和適應性免疫對WNV感染的某些特征反應，篩選出能夠引起人體免疫反應的最佳抗原片段，為后期WNV疫苗開發奠定基礎。

WNV主要在老年人中引起嚴重疾病，且年齡越大，免疫衰老和免疫反應性降低就越相關。要使WNV疫苗對老年人達到充分保護性，可能需要其能夠誘導一種強大的、持久的保護性免疫反應。迄今為止，中和抗體是保護黃病毒感染的最可靠屏障之一。此外，WNV特異性T細胞同樣發揮著重要的作用[17]。臨床試驗表明，WNV嵌合病毒候選疫苗可誘導WNV E蛋白特異性CD8+T細胞反應長達1年[25]。

通過對WNV感染和免疫過程的解析有利于探明宿主對病原體的免疫應答機制，包括先天性免疫防御、Ⅰ型干擾素抗病毒機制和免疫細胞介導的體液免疫控制機制。揭示這些機制為后續開發WNV特異性疫苗提供了重要的參考價值，但仍有幾個問題有待解決。首先需要進一步確定細胞和組織特異性基因表達的環境依賴性功能以及編碼蛋白的作用機制。其次，一些研究已經確定了介導免疫逃避的病毒因子，但作用機制尚不清楚。目前，特異性針對WNV的載體疫苗尚未開發出來，更多是通過切斷傳染源限制病毒的感染，因此研發WNV疫苗意義重大。