miRNA-370及其靶基因Wnt3a和KITLG在白色和棕色絨山羊皮膚中的表達與定位

李建平，吳素芳，李健宇，香 巴 (1.吉林農業科技學院 動物科技學院,吉林 吉林市 13109；.吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 13006)

毛色由黑色素細胞產生的真黑色素(黑色/棕色)和褐黑色素(黃色/紅色)的數量和比例決定[1]。絨山羊作為一種特種經濟動物，其生產的絨、肉和奶與人們生活息息相關。羊絨被紡織業譽為“纖維寶石”[2]，但絨山羊毛色相對較少，不能滿足紡織業及消費者的需求，因此，近年來有關絨山羊毛色形成機制的研究逐漸增多，特別是影響黑色素合成的色素基因研究。miRNA是一類內源性、非編碼、參與轉錄后調控的RNA分子，通過結合mRNA的3′UTR或開放閱讀框調節基因表達，在細胞增殖、遷移、分化及疾病發生等過程中發揮著重要作用。研究表明，miR-370可抑制肝癌發生，是潛在的治療靶點[3]。此外，miR-370還可通過靶向EGFR調節胃癌細胞的增殖和分化，EGFR通常在胃癌中高表達，因而被作為胃癌的篩查指標[4]。miR-370還可通過與circRNA結合促進胃癌細胞內質網應激引起的細胞凋亡[5]。本課題組前期研究發現miR-370與毛囊發育及雄激素性脫發有關，而且在不同毛色皮膚中差異表達[6]，但其是如何通過作用色素基因調控動物毛色的仍不清楚。

Wnt家族由19個高度保守的分泌糖蛋白組成，參與多種細胞過程，如增殖、遷移和自我更新[7]。Wnt信號通路分為經典的Wnt/β-catenin信號通路和非經典的Wnt信號通路[8]，其中Wnt3a通過經典的Wnt/β-catenin信號通路在黑色素細胞的發育中發揮重要作用，可促進黑色素的合成[9]。研究顯示，缺乏Wnt1和Wnt3a的突變小鼠幾乎完全沒有黑色素細胞[10]。體外研究發現，Wnt1和Wnt3a缺失的神經嵴細胞成為神經元而非黑素細胞[11]，而經Wnt3a處理可使其分化成為黑色素細胞而非神經元和膠質細胞[12]。ZHAO等[13]發現microRNA-27a-3p通過靶向Wnt3a抑制小鼠皮膚黑色素細胞的黑色素生成。

KITLG是KIT基因的配體，在造血、黑色素生成和配子生成中起重要作用[14]。KITLG/KIT通路在黑色素合成中的作用，不僅包括成黑素細胞和黑素細胞的遷移，還能維持出生后皮膚的黑色素生成[15]，在毛囊上皮細胞中表達的KITLG對黑素細胞的終末分化起重要作用[16]。KIT突變會導致花斑病的形成，患者在腹側和/或骶部皮膚表面出現無色斑癥狀[17]。

本試驗選取miR-370為研究對象，通過qPCR和免疫組化技術分析miR-370、Wnt3a和KITLG在不同毛色絨山羊皮膚組織中的表達、分布及相互關系，為人工調控動物毛色奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本采集隨機選取白色和棕色絨山羊各3只，在肩胛部采集皮膚組織，立即置入液氮保存。

1.2 主要試劑和器材TRIzol裂解液、qPCR試劑盒、木瓜蛋白酶、SP(兔IgG)-POD Kit、Mayer’s蘇木素染液購自北京索萊寶生物科技公司；烏賊墨購自中國藥品生物制品檢定所； Wnt3a、KITLG抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司；臺式微量冷凍離心機、TG16-W微量離心機購自賽默飛世爾科技公司；冰凍切片機CM1950購自德國LEICA公司；電熱恒溫水槽DK-80型購自上海一恒科技有限公司。

1.3 不同毛色絨山羊皮膚黑色素含量測定取絨山羊皮膚組織剪碎，加入木瓜蛋白酶和蒸餾水，55℃水浴加熱16 h，離心后棄去上清，再依次經石油醚、無水乙醇和蒸餾水清洗，烘干得到皮膚樣品。稱取2 mg的烏賊墨，溶解在0.1 mol/L NaOH中，使其終質量濃度為200 mg/L，在80℃的水浴中加熱使其溶解。制備黑色素標準曲線：在酶標板中加入配制好的烏賊墨，200 μL/孔，使各孔的質量濃度分別是0，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200 mg/L，每孔加入200 μL制備好的皮膚樣品，放入酶標儀并檢測波長500 nm處吸光度值，并根據測得的結果繪制黑色素標準曲線，計算樣品的黑色素濃度及皮膚組織黑色素含量。

1.4 不同皮膚組織miR-370和靶基因的表達TRIzol裂解法提取組織RNA后進行反轉錄與熒光定量分析。反轉錄按照試劑盒說明書操作，總體系為20 μL，反應條件：37℃，5 min；42℃，60 min；70℃，5 min。qPCR反應體系：10 μL 2×FastStart Essential DNA Green Master，1 μL cDNA，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。qPCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，35個循環。miR-370和靶基因分別采用U6和GADPH作為內參(引物序列見表1)。

表1 引物信息

1.5 Wnt3a和KITLG在白色和棕色絨山羊皮膚的分布將皮膚組織取出，包埋后切片，展片后用丙酮固定，PBS清洗3次，每次4 min，滴加3% H2O2，室溫避光放置10 min，蒸餾水洗3次，滴加封閉液，室溫30 min后甩去液體，加入Wnt3a(1∶200)和KITLG(1∶200)抗體，對照組加入PBS，4℃孵育過夜。用PBS洗滌3次，每次2 min，加入Biotin標記的羊抗兔IgG工作液(1∶100)，室溫孵育30 min，PBS洗滌后滴加DAB顯色液，置于顯微鏡下觀察和控制反應時間，蒸餾水洗滌終止反應，滴加蘇木素進行輕度復染，用自來水沖洗返藍，常規脫水、透明、甩干，用中性樹膠封片后顯微鏡下觀察結果。

1.6 統計學分析采用SPSS 19.0 進行統計學分析，并進行t檢驗(P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性差異)。

2 結果

2.1 白色和棕色絨山羊皮膚組織中miR-370的表達為檢測miR-370與絨山羊毛色形成的相關性，采用qRT-PCR檢測了miR-370在白色和棕色絨山羊皮膚組織中的表達，結果如圖1所示，棕色絨山羊皮膚組織中miR-370的表達顯著高于白色絨山羊皮膚組織(P<0.05)。

圖1 白色和棕色絨山羊皮膚組織中miR-370的表達

2.2 白色和棕色絨山羊皮膚組織中的黑色素含量為檢測白色和棕色絨山羊皮膚組織中黑色素含量的差異，采用NaOH裂解法測定了兩種毛色絨山羊皮膚組織中的黑色素含量，結果如圖2所示，棕色絨山羊皮膚組織的黑色素含量極顯著高于白色絨山羊皮膚組織的黑色素含量(P<0.01)。

圖2 白色和棕色絨山羊皮膚組織中黑色素含量

2.3 Wnt3a和KITLG 在白色和棕色絨山羊皮膚組織中的表達采用qRT-PCR法檢測了miR-370的靶基因(Wnt3a和KITLG )在白色和棕色絨山羊皮膚組織中的表達，結果如圖3所示，棕色絨山羊皮膚組織中Wnt3a和KITLG的表達均顯著高于白色絨山羊皮膚組織。

圖3 Wnt3a、KITLG在白色和棕色絨山羊皮膚中的表達

2.4 Wnt3a和KITLG在白色和棕色絨山羊皮膚組織中的分布采用免疫組化方法測定了不同毛色絨山羊皮膚組織中Wnt3a和KITLG的分布，結果顯示，Wnt3a、KITLG在絨山羊皮膚組織的表皮和內、外根鞘均有表達，在棕色絨山羊皮膚組織的毛乳頭也有表達(圖4，5)。但不同被毛顏色絨山羊Wnt3a和KITLG表達水平不同，在白色絨山羊中，Wnt3a和KITLG染色呈弱陽性(圖4A，C)，而在棕色絨山羊中，Wnt3a和KITLG染色呈強陽性(圖5A，C)，對照組未見陽性染色(圖4B，5B)。

A，C.分別為Wnt3a、KITLG在白色絨山羊皮膚的表達；B.對照組。1，2，3，4分別為基底層、內、外根鞘和毛乳頭圖4 Wnt3a和KITLG在白色絨山羊皮膚組織中的分布(10×)

A，C.分別為Wnt3a、KITLG在棕色絨山羊皮膚的表達；B.對照組。1，2，3,4分別為基底層、內外根鞘和毛乳頭圖5 Wnt3a和KITLG在棕色絨山羊皮膚組織中的分布(10×)

3 討論

黑色素細胞通過產生黑色素在皮膚和頭發色素沉積中發揮關鍵作用，它們起源于神經嵴的黑素母細胞，在胚胎發生過程中遷移到表皮和毛囊中[18]。黑色素細胞在黑色素小體中合成黑色素，然后將黑色素顆粒轉移到相鄰的角質形成細胞，最終積聚生成有色皮膚或不同顏色的毛發[19]。本研究通過酶解法提取皮膚黑色素，以NaOH溶解法測定黑色素含量[20]，發現棕色絨山羊皮膚的黑色素含量顯著高于白色絨山羊皮膚黑色素含量，這一結果與HU等[21]發現黑色獺兔皮膚黑色素含量多，而白色獺兔皮膚黑色素含量少的結果一致，表明深色皮膚中黑色素含量較多。

研究人員通過檢測黑素細胞靶向的Dct-LacZ轉基因小鼠，發現Wnt3a蛋白在毛囊發育的生長期，在表皮、隆起處、內根鞘前體細胞和毛球細胞(包括黑素細胞和黑色素干細胞)高表達；在退行期，Wnt3a的表達逐漸下降，僅表達在隆起處；在休止期，毛囊內未見Wnt3a蛋白表達；當毛囊發育進入下一個生長期時，Wnt3a蛋白再次在毛球和黑素細胞中表達[9]。研究人員通過免疫組化檢測了Wnt3a在羊駝皮膚組織中的表達，發現Wnt3a廣泛表達于毛球、根鞘和表皮，且高表達于棕色羊駝皮膚[22]。本研究也發現Wnt3a在絨山羊皮膚組織的表皮、毛乳頭和內、外根鞘表達，且在棕色絨山羊皮膚組織中高表達，表明Wnt3a參與動物毛發顏色的形成。

據報道，KITLG在黑素細胞的終末分化中起關鍵作用，為頭發色素沉積所必需[14]。KITLG及其受體KIT的變異會導致色素沉積的改變。在人類，KITLG基因的編碼序列變異已被證明可導致家族進行性色素沉積，伴有或不伴有色素沉積，以及2型阿斯瓦爾登堡綜合征(伴有色素異常)。在對過表達miR-137的轉基因小鼠的研究中發現，通過抑制KITLG/KIT信號通路中KIT和TRP-2的表達可抑制小鼠黑色素細胞的黑色素合成[23]。研究發現在絨山羊和水貂中，淺色動物的KITLG表達低于深色動物[24-25]。本研究發現KITLG表達于表皮、內、外根鞘和毛乳頭，且在棕色絨山羊皮膚中表達量較高，表明KITLG在毛色形成中發揮重要作用。

綜上，本研究通過分析miRNA-370和靶基因在絨山羊皮膚的表達及分布，發現Wnt3a、KITLG在絨山羊皮膚組織的表皮和內、外根鞘及棕色皮膚組織的毛乳頭有表達；miR-370在棕色絨山羊皮膚中的表達量及黑色素含量均高于白色絨山羊，表明miR-370可能通過正調控靶基因Wnt3a、KITLG從而作用于絨山羊毛色的形成。本研究為闡明絨山羊毛色形成機制奠定了科學的理論基礎。