4種家兔呼吸道致病菌多重PCR的建立及初步應(yīng)用

仇汝龍，范志宇，胡 波，宋艷華，魏后軍，陳萌萌，朱偉峰，薛家賓，王 芳 (江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程重點實驗室，江蘇 南京 210014)

兔呼吸道疾病由細菌、支原體和病毒等因素引發(fā)，在兔疾病中發(fā)生率僅次于兔腸道疾病[1-2]。隨著我國家兔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，中國已經(jīng)成為世界家兔養(yǎng)殖和消費的大國，兔養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模化和集約化造成疾病的快速傳播，其中呼吸道疾病的發(fā)病率也急劇增加[3]。根據(jù)家兔呼吸道病流行病學(xué)調(diào)查[4]，細菌是引發(fā)兔呼吸道疾病的主要病因，其中多殺性巴氏桿菌是家兔呼吸道疾病的主要致病菌，普遍存在于群居的家兔，常感染成年兔引起兔鼻炎、肺炎及敗血癥等疾病，且發(fā)病率和致死率隨兔日齡而增長[5]。在患有呼吸道疾病的兔中常常會檢出支氣管敗血波氏桿菌，因此該菌被認為是共生病原或者是多殺性巴氏桿菌致病的誘因。然而與多殺性巴氏桿菌不同的是，支氣管敗血波氏桿菌經(jīng)常感染幼兔并導(dǎo)致其發(fā)病[6-7]；銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌也被認為是常導(dǎo)致兔呼吸道病的致病菌[8]，其臨床癥狀與多殺性巴氏桿菌相似，患病兔在臨床上主要表現(xiàn)為精神不振、呼吸困難和食欲消退等癥狀；肺部癥狀主要有肺出血、化膿等[9]。4種呼吸道致病菌引發(fā)的疾病的臨床癥狀與肺部病理變化相似，且常常為混合感染，不利于臨床鑒別和診斷。另外，銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌也是引發(fā)人下呼吸道感染的主要致病菌。國內(nèi)外報道顯示，銅綠假單胞菌的感染率常年居下呼吸道感染的首位[10]。因此，建立可快速、有效地鑒定常見家兔呼吸道致病菌的診斷方法迫在眉睫。

本研究建立的4種常見家兔呼吸道疾病致病菌多重PCR方法，可以對銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌進行快速鑒定，對于疾病診斷和細菌分離鑒定具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與臨床樣本兔源多殺性巴氏桿菌C51-17株(保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號：CCTCC M 2018401)、銅綠假單胞菌JS17株、支氣管敗血波氏桿菌JS06株、肺炎克雷伯氏菌SD18株(由本實驗室分離鑒定并保存)、腸炎沙門菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、兔出血癥病毒、金黃色葡萄球菌均由筆者所在實驗室提供。臨床樣本來自山東、四川、江蘇、浙江、福建、河南等地區(qū)的規(guī)模化兔場采集的37份肺臟和21份鼻拭子。

1.2 主要試劑與儀器TaqPro HS DNA聚合酶購自諾唯贊生物科技股份有限公司；DL2000 DNA Marker和瓊脂糖等購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；核酸蛋白測定儀NanoDrop購自美國賽默飛世爾公司；Eppendorf Mastercycler PCR儀購自美國艾本德中國有限公司；冷凍研磨儀MB-48LD購自浙江美壁儀器有限公司；高速冷凍離心機Centrifuge 5804R購自美國艾本德中國有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成參考GenBank中已發(fā)布的多殺性巴氏桿菌KMT1基因(GenBank登錄號:CP028927.1)、支氣管敗血波氏桿菌flaA基因(GenBank登錄號:CP022962.2)、銅綠假單胞菌gyrA基因(GenBank登錄號：NC002516.2)和肺炎克雷伯氏菌rcsA基因序列[11](GenBank登錄號：NC_016845.1)，利用Primer3.0軟件設(shè)計4對特異性引物[12]，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，引物序列及及相關(guān)信息見表1。

表1 多重PCR引物序列及相關(guān)信息

1.4 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化將銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌的DNA分別稀釋至100 μg/L，等量混勻作為核酸模板。多重PCR反應(yīng)優(yōu)化包括退火溫度的優(yōu)化(55.1，55.6，56.3，57.5，58.8，60.0，61.2，62.5℃)以及多重引物濃度優(yōu)化(由25 μmol/L倍比稀釋為8個濃度梯度)。PCR反應(yīng)體系：5×Taq Pro Buffer(Mg2+Plus) 5 μL ，Taq Pro HS DNA聚合酶0.25 μL，4對上、下游引物(最佳濃度)共4 μL，混合模板DNA 1 μL，加ddH2O補足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性2 min；95℃ 變性 30 s，55～60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。

1.5 多重PCR特異性試驗制備多殺性巴氏桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和支氣管敗血波氏桿菌DNA的混合和單一模板，另外分別提取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和沙門菌的DNA及兔出血癥病毒RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，以ddH2O為空白對照，進行特異性檢測。

1.6 多重PCR敏感性試驗將銅綠假單胞菌、多殺性巴氏桿菌、肺炎克雷伯氏菌和支氣管敗血波氏桿菌的DNA調(diào)整至100 μg/L，等量混合至每種細菌DNA的質(zhì)量濃度為25 μg/L，以10倍梯度進行稀釋，稀釋至第8個稀釋度，檢測該多重PCR對4種細菌病原的敏感性。

1.7 人工感染及兔肺臟病原菌的多重PCR檢測將25只4月齡試驗兔隨機分為試驗組和對照組，每組5只，采用肺部注射的方式進行人工感染，注射劑量為1 mL，攻毒劑量分別為多殺性巴氏桿菌 20 CFU、支氣管敗血波氏桿菌 1×109CFU、肺炎克雷伯菌 1×102CFU、銅綠假單胞菌 1×108CFU。由于多殺性巴氏桿菌感染發(fā)病較快，所以接種后24 h，對5只接種多殺性巴氏桿菌的試驗兔實施安樂死并取肺臟。攻毒后48 h，取剩余試驗兔肺臟，進行勻漿和離心，收取上清為目的樣品。分別以4種病原菌感染肺臟的樣品等比例混合作為混合樣品和未感染兔肺臟樣品為模板，按照試劑盒說明書提取細菌DNA并進行PCR檢測。

1.8 臨床樣品的檢測利用已建立的4種家兔呼吸道致病菌多重PCR方法，對從山東、四川等地區(qū)的規(guī)模化兔場采集的37份具有明顯病變的肺組織和21份具有明顯鼻炎癥狀兔的鼻試子進行檢測。同時與單一PCR檢測結(jié)果進行比較，以驗證該多重PCR方法的可靠性。單一PCR檢測參照TOWNSEND等[13]建立的多殺性巴氏桿菌特異性PCR方法，HOZBOR等[14]建立的支氣管敗血波氏桿菌特異性PCR方法，張偉等[15]建立的銅綠假單胞菌PCR檢測方法，王貴升等[16]建立的肺炎克雷伯氏菌PCR檢測方法。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR反應(yīng)的建立及條件優(yōu)化以銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌的DNA作為模板進行擴增，試驗溫度分別為55.1，55.6，56.3，57.5，58.8，60.0，61.2，62.5℃；混合引物濃度由25 μmol/L倍比稀釋至第6稀釋度。結(jié)果表明，退火溫度為57.5℃時擴增效果最佳(圖1)，最佳的引物終濃度為125 nmol/L(圖2)。經(jīng)優(yōu)化后，多重PCR反應(yīng)體系：5×PCR Buffer(Mg2+Plus)5 μL，引物(每種引物濃度為6.25 μmol/L，各0.5 μL)4 μL，模板DNA 2 μL，Taq Pro HS DNA聚合酶 0.5 μL，ddH2O 13.5 μL。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，57.5℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸7 min。

M.DL2000 DNA Marker；1～8. 55.1～62.5℃圖1 PCR退火溫度的優(yōu)化

M.DL2000 DNA Marker;1～8.500.00～3.90 nmol/L圖2 PCR引物濃度的優(yōu)化

2.2 特異性試驗使用本試驗建立的4重PCR方法對兔源銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌樣品的目的基因進行特異性擴增，條帶大小分別為797，558，321，122 bp，而對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、魏氏梭菌和沙門菌、兔病毒性出血癥病毒cDNA和超純水均無特異性條帶(圖3)，表明該方法具有較好的特異性。

M.DL2000 DNA Marker；1.4種細菌混合模板；2.銅綠假單胞菌；3.肺炎克雷伯氏菌；4.多殺性巴氏桿菌；5.支氣管敗血波氏桿菌；6.金黃色葡萄球菌；7.大腸桿菌；8.產(chǎn)氣莢膜梭菌；9.沙門菌；10.兔出血癥病毒cDNA；11.陰性對照圖3 PCR特異性試驗

2.3 敏感性試驗敏感性試驗結(jié)果表明，本試驗建立的多重PCR方法對銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌DNA的最低檢出質(zhì)量濃度分別為2.5×10-1，2.5×100，2.5×10-2，2.5×10-2μg/L(圖4)。

M.DL2000 DNA Marker；1～7. 2.5×101～2.5×10-5 μg/L圖4 PCR敏感性試驗

2.4 人工感染及兔肺臟多重PCR檢測通過肺部注射方式人工感染20只試驗兔，于接菌后24，48 h采集兔肺臟，分別取4種致病菌感染組的一份兔肺臟樣本等比例混合，最后獲得5份包含4種致病菌的混合樣本，對照組混合成為1份樣本，對6份樣本進行多重PCR檢測。結(jié)果顯示，5份混合細菌樣本均檢測為陽性，對照組則為陰性(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker；P.陽性對照；N.陰性對照；1～5. 4種細菌混合兔肺臟樣本；6.對照組兔肺臟樣本圖5 多重PCR檢測人工感染兔肺臟

2.5 臨床樣品的檢測應(yīng)用建立的多重PCR方法對兔37份肺組織和21份鼻拭子進行檢測(表2)。比較多重PCR與單一PCR的檢測結(jié)果，可見兩種方法的陽性檢出率無顯著性差異(P>0.05)，說明該多重PCR方法具有可靠性。

表2 臨床樣本PCR檢測結(jié)果

3 討論

隨著家兔養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，中國已成為世界第一家兔養(yǎng)殖、出口及消費大國。家兔養(yǎng)殖的發(fā)展也正向規(guī)模化、集約化、機械化和程序化邁進，然而養(yǎng)殖規(guī)模擴大導(dǎo)致疾病的快速傳播。兔呼吸道疾病對兔養(yǎng)殖業(yè)的危害僅次于兔腸道疾病，是引發(fā)兔發(fā)病和死亡的主要疾病之一。兔呼吸道疾病的誘因主要有生物因素和環(huán)境因素[17]，其中生物因素主要是致病性細菌，特別是多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌，它們也是人獸共患致病菌，對兔場人員的健康造成威脅。多殺性巴氏桿菌是兔呼吸道疾病的主要致病菌，支氣管敗血波氏桿菌也經(jīng)常在患病兔呼吸道檢出，它們引發(fā)感染的臨床癥狀相似，病理變化也難以準確區(qū)分。肺炎克雷伯氏菌和銅綠假單胞菌均會引起兔肺炎，肺炎克雷伯氏菌還會引發(fā)敗血癥等癥狀，并且它們還會和多殺性巴氏桿菌及支氣管敗血波氏桿菌混合感染兔呼吸道，導(dǎo)致難以通過臨床癥狀及病理變化準確區(qū)分。盡管鄧釗賓等[18]分別建立了針對兔出血癥病毒及細菌的4重PCR，但是尚未有針對銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌4種呼吸道疾病致病菌的多重PCR檢測方法。

本試驗根據(jù)銅綠假單胞菌的gyrA基因、肺炎克雷伯氏菌的rcsA基因、多殺性巴氏桿菌的KTM1基因和支氣管敗血波氏桿菌的flaA基因的保守區(qū)域設(shè)計多對引物，經(jīng)多次驗證后篩選出4對可同時特異性的擴增出相應(yīng)目的片段的引物，作為建立多重PCR方法的引物。通過對退火溫度和引物濃度進行優(yōu)化，獲得最佳的PCR反應(yīng)條件。敏感性試驗結(jié)果證明，本試驗建立的針對4種致病菌的多重PCR方法的最低模板質(zhì)量濃度為0.025～2.5 μg/L，低于已報道的多重PCR方法可檢測的最低模板質(zhì)量濃度，如夏穎等[19]建立的方法的最低模板質(zhì)量濃度為1 μg/L，說明該方法具有較高的敏感性，達到對臨床樣本檢測的濃度要求[20]。該多重PCR方法可特異的擴增4種致病菌的相應(yīng)靶基因片段，對其他5種常見的家兔傳染病病原均無擴增條帶，證明本方法有較強的特異性。臨床肺組織和鼻拭子樣本檢測結(jié)果顯示，多殺性巴氏桿菌和支氣管敗血波氏桿菌的檢出率較高；同時也存在綠膿桿菌、肺炎克雷伯氏菌的感染，與王孝友等[21]和任克良等[22]報道相似。該方法與單一PCR進行比對，檢測結(jié)果無明顯差異；該方法1次反應(yīng)僅耗時2.5 h，比已報道的多重PCR時間縮短1/2。

綜上所述，本試驗建立的檢測4種呼吸道疾病致病菌的多重PCR方法具有良好的特異性和靈敏性且反應(yīng)時間短，可用于家兔呼吸道病的快速鑒別診斷，可為4種家兔呼吸道傳染病的流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)手段。