羥基紅花黃色素A對LPS誘導的羊子宮內膜上皮細胞炎性反應的抑制作用

段景龍，宣超瑩，劉茂軍，馬玉忠* (.河北農業大學 動物醫學院，河北 保定 0700；.江蘇省農業科學院，江蘇 南京 004)

近年來，我國羊養殖量越來越大[1]，羊的各種疾病也隨之而來，尤其是生殖類疾病[2]。子宮內膜炎是常見的羊生殖類疾病，該病發生的主要原因是當難產、流產及胎衣不下時病原菌侵入子宮[3]。導致子宮內膜炎發生的病原菌主要為大腸桿菌，脂多糖作為其主要活性成分在致病過程中發揮著重要作用[4-5]。目前常用的治療子宮內膜炎的方法是抗生素和激素療法，但抗生素的大量使用會造成耐藥細菌的產生，并且抗生素殘留會對人類健康造成不良影響，這給養羊業的健康發展、公共衛生及食品安全帶來了巨大影響。因此，急需尋找一種安全高效且可保護子宮內膜的藥物。羥基紅花黃色素A(HYSA)是紅花中最主要的水溶性成分，該成分屬于查耳酮類化合物[6]，具有抗炎等作用。研究發現，HYSA可以減弱香煙煙霧提取物對肺泡Ⅱ型上皮細胞的誘導作用，降低炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α在細胞上清的表達量[7]。本試驗用脂多糖(LPS)構建羊子宮內膜上皮細胞炎性反應模型，用HYSA處理，探究其對LPS誘導的羊子宮內膜炎性上皮細胞的影響，以便為HYSA的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物2歲左右健康綿羊，體質量25～30 kg，來自河北農業大學實驗動物中心。在溫度16～28℃，相對濕度40%～60%條件下飼養。該研究經河北農業大學動物管理委員會批準實驗。

1.2 主要試劑DMEM/F12培養基由Gibco公司提供；HYSA購自上海綠源生物科技有限公司；Hepes、CCK-8溶液和臺盼藍購自北京索萊寶科技有限公司；LPS購自Sigma公司；胎牛血清由杭州四季青公司提供；羊TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒購自DG Biotech公司；p-JNK、p-p38抗體購自安諾倫(北京)生物科技有限公司。

1.3 羊子宮內膜細胞的原代培養在無菌條件下取羊子宮角，用含有雙抗的PBS漂洗3次，去除結締組織及脂肪，剖開子宮角，取子宮內膜，修剪成3 mm×3 mm×2 mm大小的組織塊，放入6孔板內，于37℃、5% CO2條件下培養過夜。次日，加入2 mL 含有15% FBS的DMEM/F12，于37℃、5% CO2條件下培養，每2～3 d更換培養液1次，觀察細胞生長狀況，并在10 d左右去除組織塊。

1.4 細胞傳代待孔內細胞鋪滿培養板底的80%～90%時，去除培養基，每孔用2 mL PBS洗2次，每孔加入500 μL 0.25%的胰酶，于37℃消化2 min，當顯微鏡下觀察到大部分細胞開始變圓、回縮、細胞間隙變大后，每孔加入1 mL含FBS的DMEM/F12培養基終止消化，刮取細胞，轉移至細胞瓶中繼續培養。

1.5 CCK-8法檢測HYSA對子宮內膜上皮細胞活力的影響將處于對數生長期的子宮內膜上皮細胞消化下來并調整細胞濃度為1×105個/mL，按照100 μL/孔將細胞懸液接種于96孔板中，置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養12 h。棄舊培養基，加入10，20，40，60，80，100 mg/L HYSA，每個質量濃度設5個重復，放入細胞培養箱培養12 h。每孔加入10 μL CCK-8，孵育2 h，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度。

1.6 HYSA處理將子宮內膜上皮細胞稀釋成5×105個/mL，按1 mL/孔將細胞懸液接種于24孔板中。隨機分為5組：對照組、LPS處理組、60 mg/L HYSA處理組、80 mg/L HYSA處理組、100 mg/L HYSA處理組。待細胞鋪滿培養板底的80%～90%后，去除舊培養基，對照組加入新的培養液，其余各組加入50 mg/L LPS。12 h后，用60，80，100 mg/L HYSA處理12 h。

1.7 IL-1β、IL-6和TNF-α的含量檢測收集24孔板內的細胞培養液，10 000 r/min離心5 min，收集上清液，檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。

1.8 Western blot法檢測p-p38、p-JNK蛋白的表達提取總蛋白，測定蛋白濃度。取38 μg總蛋白，經12% SDS-PAGE分離，通過半干法轉膜，用5%脫脂牛奶封閉，TBST洗膜，加入p-p38、p-JNK抗體(1∶1 000稀釋)，常溫孵育2 h，用TBST洗膜，加入堿磷酶標記二抗(1∶2 000稀釋)，孵育1 h，用TBST洗膜，用BCIP/NBT顯色。

2 結果

2.1 羊子宮內膜上皮細胞形態觀察倒置顯微鏡下可見，培養9 d時，細胞呈離散型從組織塊向周圍爬出(圖1A)； 14 d時，細胞鋪滿整個孔底，多為上皮細胞和成纖維細胞(圖1B)；純化后獲得子宮內膜上皮細胞，呈鋪路石狀(圖1C)。

A.培養9 d時細胞從組織塊遷出；B.培養14 d時的羊子宮內膜上皮細胞及成纖維細胞；C.純化后的子宮內膜上皮細胞圖1 羊子宮內膜上皮細胞形態

2.2 HYSA對羊子宮內膜上皮細胞增殖的影響如表1所示，通過CCK-8法檢測發現，用10，20，40，60，80，100 mg/L HYSA處理12，24 h，對羊子宮內膜上皮細胞的生長均有促進作用(P<0.01)，80 mg/L 時促進增殖的效果最好。子宮內膜上皮細胞經HYSA處理12 h的活力比24 h高，因此選用80 mg/L HYSA處理羊子宮內膜上皮細胞，時間為12 h。

表1 HYSA對子宮內膜上皮細胞增殖活力的影響 %

2.3 HYSA對LPS誘導的羊子宮內膜上皮細胞TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響如表2所示，用60，80，100 mg/L HYSA作用經LPS處理12 h的羊子宮內膜上皮細胞，12 h后，細胞上清中IL-β、IL-6和TNF-α的含量均有所下降，其中60，100 mg/L HYSA處理組的IL-1β、IL-6含量與模型組相比無顯著性差異； 80 mg/L HYSA處理組的IL-1、IL-6含量與模型組相比顯著降低(P<0.05)；60，80，100 mg/L HYSA處理組的TNF-α含量與對照組相比極顯著降低(P<0.01)。

表2 HYSA對子宮內膜上皮炎性細胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α的影響 ng/L

2.4 HYSA對LPS誘導的羊子宮內膜上皮細胞p-p38、p-JNK含量的影響利用 Western blot檢測p-p38、p-JNK蛋白含量，結果見圖2，與對照組相比，LPS 處理后p-p38、p-JNK蛋白水平顯著升高(P<0.01)，80，100 mg/L HYSA處理組的p-p38、p-JNK含量與模型組相比極顯著降低(P<0.01)；60 mg/L HYSA處理組p-JNK含量與模型組相比極顯著降低(P<0.01)，p-p38含量與模型組相比無顯著變化。

*表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與模型組相比差異極顯著(P<0.01)；##表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)圖2 HYSA對LPS誘導的子宮內膜上細胞p-p38、p-JNK蛋白表達的影響

3 討論

子宮內膜炎是常見的母羊生殖器官疾病，會影響母羊早期的妊娠，造成母畜的不孕[8]。引起子宮內膜炎發生的原因多種多樣，主要原因是病原微生物入侵機體所致。大腸桿菌作為一種革蘭陰性菌，是導致子宮內膜炎發生的主要致病菌之一[2]。革蘭陰性菌細胞壁內的LPS在細菌死亡時會被釋放，與Toll樣受體4結合，激活機體免疫應答，誘導炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，促使機體發生炎癥[9]。研究發現，TNF-α是炎癥早期產生的細胞因子，具有多種生物學活性，可以促進中性粒細胞黏附到上皮細胞，進而導致機體產生局部炎性反應[10]。IL-1β是一種致炎性因子，參與誘導炎癥，可以促進黏附分子的分泌，且可以誘導IL-6的分泌[11]。IL-6是一種多效應細胞因子，在免疫應答中發揮重要作用，IL-6濃度的變化可以在一定程度上反映疾病的變化[12]。張興云等[9]研究發現，藏羊子宮內膜上皮細胞經過大腸桿菌刺激后會導致炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量增加。本試驗中，用50 mg/L LPS刺激綿羊子宮內膜上皮細胞12后，IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌量顯著增加，說明綿羊子宮內膜上皮細胞發生炎癥，炎癥模型構建成功。

HYSA是一種重要的黃酮類化合物，是中藥紅花的重要成分，具有抗炎、抗腫瘤等功效[13]。張園等[14]對大鼠采取灌胃的方式飼喂HYSA，發現HYSA可降低心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中炎性因子IL-6和TNF-α的水平，并降低了NF-κB蛋白的表達，減輕炎癥反應，說明HYSA可以抑制心肌細胞炎癥反應，減輕心肌細胞損傷。DONG等[15]采用腹腔注射HYSA治療急性軟組織損傷的小鼠，發現經過HYSA治療后，小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量降低，肌肉中p-p38 MAPK含量降低，說明HYSA可能通過抑制p38 MAPK的磷酸化，從而降低IL-1β、IL-6和TNF-α的表達[15]。本試驗結果顯示，HYSA可以降低炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌，在質量濃度為80 mg/L時，炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量與模型組相比顯著降低，表明80 mg/L HYSA對LPS誘導的羊子宮內膜上皮細胞炎性反應的抑制作用最佳。

MAPK信號通路是哺乳動物體內重要的傳導通路之一，它可被LPS激活，進而產生酶促級聯反應，將刺激傳遞至細胞內引起生物學反應[16]。JNK、ERK、p38/MAPK信號通路是MAPK信號通路的組成部分。JNK、p38/MAPK信號通路與炎癥相關。李金等[17]研究發現，白藜蘆醇可以抑制p-JNK、p-p38蛋白的活化，降低RAW264.7細胞的炎性反應。本試驗結果表明，HYSA可以降低p-JNK、p-p38蛋白的表達，說明HYSA可以降低p-JNK/MAPK、p-38/MAPK信號通路的活化，從而抑制炎性反應進程。