3例犬皮膚肥大細胞瘤病理學及c-kit免疫組織化學染色研究

馬 瑩，謝騰熠，張 競，石俊超，高 蕊，徐榮藝，賀文琦，高 豐，陸慧君 (吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062)

隨著生活水平的不斷提高和人們對犬貓等動物親近感的提升，伴侶動物逐漸成為家庭的重要成員；同時蓬勃發展的動物診療技術，也提高了伴侶動物的生活質量及壽命。但動物進入老年后，罹患腫瘤的風險也隨之增加，因此對于寵物各種腫瘤的精確診斷也愈加重要。腫瘤診斷不僅可對寵物的臨床治療方案及處置方式提供指導，而且也會為動物主人提供一個寵物健康狀態的心理預期[1]。

皮膚型肥大細胞瘤(cMCT)是犬發生率較高的皮膚腫瘤之一。cMCT起源于真皮和皮下組織的肥大細胞，占所有皮膚腫瘤的16%～21%，其惡性率可達19%～39%[2]。病理組織學檢查是腫瘤診斷的金標準，絕大多數cMCT可以通過蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色及甲苯胺藍(toluidine blue，T-blue)或吉姆薩(Giemsa)等組織化學染色獲得診斷，但對于分化程度較差的cMCT，很難通過這些常規的染色技術確診；此外，cMCT和其他類型的皮膚圓形細胞瘤有一定的相似性，病理診斷時需要相互鑒別，診斷難度較大[3]。

近年來，免疫組織化學技術(immunohistochemistry,IHC)作為精確診斷小動物腫瘤的一種重要的方法已經在歐美等國家普遍應用，但在我國由于多種限制因素還未發展起來。最新研究表明，c-kit可作為低分化cMCT的特異性分子標記，在常規組織化學染色檢查基礎上，可為cMCT的精準診斷提供更為確鑿的證據；同時，KIT蛋白的不同表達模式與預后具有一定的相關性[4]。因此，本研究聯合應用HE染色、T-blue組織化學染色以及c-kit免疫組織化學染色方法，對3例臨床疑似犬cMCT進行系統的病理組織學觀察分析并作出確診，不僅為本次腫瘤病例的治療和預后提供精準指導，而且可為獸醫臨床各種分化程度的MCT診、治、防及預后分析等提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例基本情況

1.1.1病例1 巴哥犬，5歲，雄性已去勢。本次就診的2個月前，曾在右前肢、左后肢和右側尾根發生過肥大細胞瘤，病理結果顯示為2級，分化良好(其他醫院診斷結果)；之后在左腹皮膚表面發現一小凸起(圖1A)，細胞學檢測懷疑為肥大細胞瘤。

1.1.2病例2 比熊犬，6歲，雌性已絕育。約2個月前發現右后肢膝關節有1個高粱米粒大小的紅點，最近變大凸起(圖1B)，有舔舐腫塊行為。

1.1.3病例3 貴賓犬，5歲，雄性已去勢。約4年前發現左側胸壁一處有米粒大小的腫物，后期逐漸生長變大，經常瘙癢抓撓，與皮下有連接(圖1C)。

A.病例1病灶照片；B.病例2病灶照片；C.病例3病灶照片圖1 臨床病例的病灶外觀

1.2 試劑及儀器

1.2.1試劑 甲醛、乙醇、二甲苯購于國藥集團化學試劑有限公司；中性樹膠(G8590)、甲苯胺藍(G3668)購于北京索萊寶科技有限公司；伊紅(G1101)、蘇木素(G1104)購于武漢塞維爾生物科技有限公司；c-kit抗體(ab32363)購于Abcam公司；免疫組化試劑盒(KIT-9710)、DAB顯色液(MAX-001)購于福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2.2儀器 包埋機(KD-BM，科迪)，切片機(RM2245，Leica)，切片掃描儀(Panoramic 250/MIDI，3D HISTECH)。

1.3 病理組織切片制作與HE染色

1.3.1固定 將送檢組織置于10%中性福爾馬林溶液中，固定至少24 h。

1.3.2石蠟切片制作 將組織依次進行酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋；將包埋好的蠟塊固定于切片機，切片厚度3～5 μm。

1.3.3HE染色與封片 切片經二甲苯脫蠟，并依次用100%，90%，80%無水乙醇復水，放入蘇木素染液中染色5 min，用自來水沖洗返藍，80%酒精短暫脫水后，放入伊紅染液中染色3 min；將切片依次放入80%，90%，100%無水乙醇Ⅰ和Ⅱ、二甲苯Ⅰ和Ⅱ，每個步驟3 min，依次進行脫水與透明。將切片從二甲苯中撈出，組織表面滴加中性樹膠，覆蓋載玻片，風干保存。

1.4 甲苯胺藍染色對切片進行脫蠟、復水后，滴加T-blue染色液，染色5 min后用自來水沖洗，95%乙醇分化，后續步驟按照說明書進行操作。

1.5 免疫組織化學染色(c-kit)對切片進行脫蠟、復水后，在枸櫞酸鈉緩沖液中煮沸20 min進行抗原修復，滴加內源性過氧化物酶阻斷劑，PBST沖洗后使用正常動物非免疫血清進行封閉，c-kit抗體做為一抗4℃孵育過夜，PBST沖洗后滴加生物素標記的二抗，PBST沖洗3次后滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，PBST沖洗3次，滴加DAB顯色液進行顯色，自來水沖洗終止顯色后，用蘇木素進行復染。

2 結果

2.1 大體病變病例1切除腫塊大小為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，福爾馬林固定后表面呈灰黑色(圖2A)；病例2切除腫塊大小0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm，皮膚顏色正常，切開皮下有黃色膠凍樣物質(圖2B)；病例3切除物塊大小3 cm×3 cm×0.5 cm，腫塊處無毛，較正常皮膚稍紅，固定后顏色發白，切面呈灰白色(圖2C)。

A.病例1切除腫塊；B.病例2切除腫塊；C.病例3切除腫塊圖2 腫塊大體病變

2.2 HE染色結果低倍鏡下，可見腫塊均位于真皮層，無包膜包被，但與周圍組織界限清楚。腫塊內部可見大量增生的嗜堿性深染的腫瘤細胞，這些腫瘤細胞或呈片狀致密分布(圖3A)，或零星的散布排列在嗜堿性的黏液樣物質中(圖3B)，或呈條索狀或小梁狀排列(圖3C)。周圍正常組織因受到腫物壓迫而發生變形，腫物邊緣部分區域有發生出血及炎性細胞的浸潤。高倍鏡下，觀察到腫瘤細胞為圓形，胞質呈藍灰色，核呈圓形位于中央，部分腫瘤細胞形態類似于“煎荷包蛋樣”外觀，細胞異型性較低，未見有絲分裂相(圖3D)。有些區域可見嗜酸粒細胞聚集及膠原纖維溶解形成“火焰狀”外觀(圖3E，F)。從病理切片可見病例1和病例3手術邊緣較為完整，未見有散在的腫瘤細胞，腫瘤切除干凈；病例2手術邊緣處仍可見散在的腫瘤細胞，不排除復發的可能性。

A.深染的腫瘤細胞呈片狀排列；B.散在分布的腫瘤細胞；C.條索狀分布的腫瘤細胞；D.腫瘤區域部分腫瘤細胞呈現“煎蛋樣”形態特征；E.腫瘤區域嗜酸粒細胞聚集；F.腫瘤區域內可見部分膠原纖維溶解圖3 組織切片HE染色結果

2.3 T-blue染色結果組織切片經T-blue染色后，鏡下觀察可見腫瘤細胞胞質內顆粒物質呈強陽性反應，表現為藍紫色(圖4A，B，C)。

A.病例1組織切片；B.病例2組織切片；C.病例3組織切片圖4 組織切片T-blue染色結果

2.4 c-kit免疫組織化學染色結果3個病例樣本中的腫瘤細胞c-kit染色均呈陽性。病例1 c-kit陽性信號多為膜周標記(圖5A)；病例2多為胞內點狀或斑塊狀標記，可見小部分聚集性彌漫性標記(圖5B)；病例3 c-kit陽性信號以胞質彌漫性標記為主(圖5C)。

2.5 病理診斷根據HE染色和T-blue染色的結果，3個病例的腫瘤組織中均可見有“煎蛋樣”的腫瘤細胞形態及胞質顆粒藍紫色的著色反應，同時見有膠原纖維溶解和嗜酸粒細胞浸潤的反應，符合MCT的形態學特征。進一步結合c-kit免疫組織化學染色的結果綜合分析，確定3個病例均屬于cMCT。其中，病例1和病例2的腫瘤細胞分化良好，屬于low grade(two tier system)[5]或grade Ⅰ (three tier system)[6]，病例3的腫瘤細胞屬于中等程度分化，可分級為low grade(two tier system)或grade Ⅱ(three tier system)。

A.病例1組織切片；B.病例2組織切片；C.病例3組織切片圖5 送檢組織切片c-kit免疫組織化學染色結果

3 討論

MCT可發生在犬身體的多個部位，最常見的是皮膚，其次是皮下；不同品種的犬都可發生，拳師犬、哈巴狗、波士頓犬的發生率更高。根據大量的統計資料分析，MCT尚無性別或年齡的相關性，但cMCT的發生率會隨著年齡的增長而增加，平均好發年齡為9歲[7]，但也曾有2周齡的幼犬發生cMCT的相關病例報告。

病例1腫物的表面顏色呈灰黑色，提示其組織內可能有出血現象，這一推測已通過組織學切片分析結果證實；病例2腫物的中間存在黃色膠凍樣滲出物，顯微鏡下觀察證實其為嗜堿性的黏液樣物質。經HE染色的病理組織切片分析，確定3個病例的腫塊均位于真皮中；腫塊區域內的細胞呈卵圓形，體積較大，呈現散在、條索狀或片狀的排列方式；胞漿內可見大量的嗜堿性顆粒；細胞核呈圓形或橢圓形。這些大量增生的細胞形態符合圓形細胞特征，初步認為是肥大細胞。部分腫瘤區域可見嗜酸粒細胞聚集及膠原纖維溶解，推測可能與臨床檢查中按壓觸診導致肥大細胞脫顆粒，釋放組胺等炎性物質有關。

獸醫臨床中，常常采取操作方便、快捷的細針穿刺抽吸方法進行細胞學檢查來診斷犬MCT。但細胞學檢查對肥大細胞辨識度比較低，容易造成誤診，而且對于腫瘤細胞的分化程度、MCT病理分級以及腫瘤切除的完整性均無法準確判斷。因此，病理組織學分析在MCT診斷中仍是公認的最精確全面的診斷方法。但是，cMCT可能與好發于皮膚的髓外漿細胞瘤、組織細胞瘤等其他類型的圓形細胞瘤具有相似的病理特征，當部分細胞的形態特征不夠典型時，很難通過HE染色進行診斷[8]。為進一步確定腫瘤細胞類型，本試驗進行了T-blue染色?？梢娔[瘤細胞胞漿內含有大量著染藍紫色的均一性顆粒，符合肥大細胞的著色特征；組織中的其他細胞則呈現均勻淡藍色的陰性著色，故可排除其他圓形細胞瘤的可能，診斷為cMCT[1]。

用于犬的MCT的病理分級體系主要有兩種。最早是PATNAIK等[5]和BOSTOCK[9]提出的Patnaik分級體系(three tier system)，該體系將cMCT分為3種，分別為分化良好(GradeⅠ)、中等程度分化(GradeⅡ)和分化較差(Grade Ⅲ)；級別越高，患犬存活時間越短，腫瘤轉移和復發率也越高。但是，不同病理學家應用該體系分級的一致性較低，易造成診斷混亂。2011年，KIUPEL等[6]提出了MCT兩級分級方法(two tier system)，將cMCT分為低等級(low grade)和高等級(high grade)。研究顯示，該方案在不同病理學家之間的診斷一致性大于97%，且該分級體系與腫瘤的預后有顯著的相關性。因此，專家認為，兩級分級體系更適合犬cMCT的分級[10]。本研究依據上述不同的分級體系，對3個病例進行了分級診斷。病例1和病例2中腫瘤細胞分化良好，細胞大小、形態均與正常細胞無明顯差異，異型性較低，并且腫瘤區域與正常組織界限清晰，沒有出現侵犯正常組織跡象，所以將這兩個病例的腫瘤分級歸屬于gradeⅠ(three tier system)或low grade(two tier system)；病例3的腫瘤細胞中等分化，且腫瘤區域與周圍組織的界限比較模糊，有侵犯正常組織的現象，分級為grade Ⅱ (three tier system)或low grade (two tier system)。

研究表明，c-kit基因突變在20%～30%的犬MCT發生中起核心作用，甚至可根據該基因的突變情況，選擇toceranib、imatinib和masitinib等特異性的靶向藥物進行腫瘤的干預治療[11]。c-kit基因編碼酪氨酸激酶跨膜受體(KIT蛋白)，基因突變后誘導KIT蛋白持續活化，導致下游信號不受控制，肥大細胞發生不可控的異常增殖，進而引起腫瘤的發生[12-14]。根據KIT蛋白在細胞中的表達特點，可以對術后腫瘤復發與轉移的可能性進行評估。KIT蛋白呈膜周(KITⅠ)標記時，一般預后較好，復發或轉移可能性較低；而KIT蛋白陽性信號呈胞質點狀和斑塊狀(KITⅡ)或彌漫性(KIT Ⅲ)標記時，一般預后較差，術后存活時間較短，復發及轉移的可能性較大[11,15]。本研究中，病例1和2腫瘤細胞KIT蛋白多為KIT Ⅰ和KITⅡ標記，病例3中腫瘤細胞以KIT Ⅲ標記為主。結合HE染色結果，病例1手術邊緣完整，腫瘤切除干凈，KIT蛋白以KIT Ⅰ標記為主，推測預后良好；病例2的手術邊緣仍可見到散在的腫瘤細胞，手術切除不完全，并且KIT蛋白以KIT Ⅱ型標記較多，存在復發的可能性；病例3的腫瘤細胞分化程度中等，c-kit免疫組化染色有較多KIT Ⅲ型標記，推測該病例腫瘤復發及轉移的可能性較高。

目前臨床上對于犬的MCT，主要有3種治療方法，即外科手術切除、化療和放療。外科手術切除是最常用的治療方法，腫塊邊緣2～3 cm是目前認為比較科學的切除范圍[1]。對于c-kit基因突變導致的犬MCT，可以選擇特異性的靶向藥物治療。對于未明確c-kit突變導致的MCT，可以選擇長春花堿(vinblastine，VLB)、潑尼松龍(prednisolone)和洛莫司汀(lomustine)等常規化療藥物。由于放射線療法可能引起組織胺的釋放，在執行之前建議給予固醇類藥物。病例1腫瘤病理分級低，KIT蛋白以KIT Ⅰ為主，完整手術切除后應有不錯的預后。病例2和病例3腫瘤病理分級較高，KIT蛋白以KIT Ⅱ和KIT Ⅲ為主，因此建議外科手術切除后給予常規的化療藥物配合治療，進一步可進行c-kit基因的突變分析，選擇更加精準的靶向藥物治療。同時，應及時追蹤患寵恢復情況。