綿羊乳腺上皮細胞的分離鑒定及炎性模型的建立

宣超瑩，段景龍，劉茂軍，馬玉忠* (.河北農業大學 動物醫學院，河北 保定 0700；.江蘇省農業科學院，江蘇 南京 004)

乳腺上皮細胞是一種具有合成和分泌乳汁功能的特化細胞[1]，是機體黏膜免疫系統的一部分，是抵御病原體的第一道屏障[2]。大量研究表明，微生物感染是乳房炎發生的主要原因，以葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主[3-4]。乳房炎會造成乳品質下降，嚴重影響著養羊業的發展。目前藥物治療乳房炎是普遍使用的方法，但效果不甚理想，通過體外試驗進行乳房炎的研究相對較少。本研究旨在獲得同一性高、純度高、活力強的乳腺上皮細胞，并建立乳腺上皮細胞炎性模型，為進行體外研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物2歲左右健康泌乳期綿羊，體質量25～30 kg，來自河北農業大學實驗動物中心。在溫度16～28℃，相對濕度40%～60%條件下飼養。該研究經河北農業大學動物管理委員會批準。

1.2 主要試劑DMEM/F12、Ⅰ型膠原酶、0.25% Trypsin購自Gibco公司；CCK-8試劑盒購自Solarbio公司；CK-18抗體購自Abcom公司；TLR-4抗體購自Bioss公司。

1.3 乳腺組織的采集和處理無菌條件下采集5 cm×5 cm×5 cm乳房基部組織，用含有青、鏈霉素的PBS進行清洗，去除結締組織，并將組織塊剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的小塊，清洗到沒有奶漬和血漬為止。

1.4 組織塊法將剪碎的組織塊轉入6孔板中，于37℃、5% CO2條件下培養6 h，每孔加入2 mL含15% FBS的DMEM/F12繼續培養，2～3 d換液1次。

1.5 酶消化組織塊法向組織塊中加入0.25%Ⅰ型膠原酶，37℃振蕩消化1.5 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清，轉入6孔板中，37℃、5% CO2條件下培養過夜，加入2 mL含15% FBS的DMEM/F12繼續培養。

1.6 酶消化法向組織塊中加入0.25%的胰酶(Trypsin)于37℃振蕩消化15 min后，1 000 r/min離心5 min，棄上清,加入2倍體積10%Ⅰ型膠原酶，37℃振蕩消化1.5 h后用100 μm孔徑濾網過濾，收集濾液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含15% FBS的DMEM/F12重懸細胞，置于細胞瓶中，于37℃、5% CO2條件下培養。

1.7 細胞純化及傳代待細胞長到80%～90%時，棄培養基，用PBS洗2遍，以EDTA-Trypsin 于37℃作用1～2 min，加入含15% FBS的DMEM/F12終止消化。將成纖維細胞吹打下來，棄去液體，用PBS洗2次，加入含15% FBS的DMEM/F12繼續培養。重復2～3次后得到較為純凈的乳腺上皮細胞。待純凈的細胞再次長滿，用PBS清洗后，加入EDTA-Trypsin 于37℃作用4 min，用含15% FBS的DMEM/F12終止消化，傳代到培養瓶中繼續培養。

1.8 姬姆薩染色待第7代細胞鋪滿瓶底時棄去原培養基，用PBS洗3遍，加姬姆薩染色A液靜置2 min，加入等量B液混勻，靜置5 min，洗去多余染色液，晾干后封片，觀察。

1.9 乳腺上皮細胞的免疫熒光染色將細胞鋪到含蓋玻片的平皿中，于37℃、5% CO2條件下培養12 h，用4%多聚甲醛固定；PBS浸洗3次后用0.2% TritonX-100進行通透；PBS浸洗后用1% BSA封閉；加CK-18一抗(1∶100稀釋)，4℃孵育過夜；用PBS浸洗后加二抗(1∶100稀釋)，37℃孵育35 min；用PBS浸洗3次，加10 mg/L DAPI，作用5 min；用PBS洗滌后吸干水分，封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.10 乳腺上皮細胞的RT-PCR鑒定提取細胞總RNA，通過反轉錄得到cDNA。以cDNA為模板，通過引物(β-酪蛋白-F：5′-TGCTACTCATCTTTATTTTGGAC-3′；β-酪蛋白-R：5′-TTCCTAAAACATTTGCAGTCA-3′)，進行PCR擴增。25 μL PCR反應體系：2×Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA 2 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL。反應程序：94℃預變性30 s；94℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR擴增產物。

1.11 乳腺上皮細胞的生長曲線純化好的上皮細胞用EDTA-Trypsin消化后，用DMEM/F12重懸細胞，接種到96孔板中，每隔24 h用CCK-8法測D值，連測7 d，繪制生長曲線。

1.12 構建炎性模型的LPS最適質量濃度的篩選將細胞鋪到96孔板中，隨機分為3個組，每組使用0，5，10，20，50 mg/L LPS處理，每個質量濃度5個孔，3個組在37℃、5% CO2條件下分別處理6，12，24 h。每孔加10 μL CCK-8作用1 h，測D450值，計算相對增長率。

細胞相對增長率(%)=(D加藥組-D空白組)/(D對照組-D空白組)×100%

1.13 ELISA法檢測細胞培養上清中IL-8和TNF-α的濃度將細胞鋪到96孔板中，分成2組，每組5個孔。分別用0，10 mg/L LPS處理12 h，收集細胞培養上清，用ELISA法檢測IL-8和TNF-α濃度。

1.14 Western blot法檢測TLR-4蛋白的表達將細胞鋪到24孔板中，分別使用0，5，10，20，50 mg/L的LPS處理12 h。提取總蛋白，測定蛋白濃度。以40 μg總蛋白/孔的量在12% SDS-PAGE進行電泳，通過半干法轉膜，用5%脫脂奶封閉，用TLR-4一抗(1∶1 000稀釋)孵育過夜，用TBST洗膜，加入堿性磷酸酶標記二抗(1∶2 000稀釋)，孵育1 h，TBST洗膜后進行顯色。

1.15 數據處理用SPSS 10.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，評估試驗組之間的差異，并使用Dumcan方法進行多重比較，用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖。

2 結果

2.1 乳腺上皮細胞的形態觀察通過組織塊法進行細胞分離，培養5 d后，可見有少量成纖維細胞從組織塊遷出，呈紡錘形或者星形(圖1A)，培養11 d左右可見有上皮細胞遷出；通過酶消化組織塊法進行細胞分離，在消化培養第3 天可見有極少量的成纖維細胞遷出，第7天可見乳腺上皮細胞呈暈狀出現，細胞形態呈多邊形，均一良好，排列緊密(圖1B)；通過酶消化法進行細胞分離，鋪板次日可見有細胞貼壁，部分細胞向外延伸呈島嶼狀，由于消化下來的細胞為成纖維細胞和上皮細胞，會出現成纖維細胞包圍上皮細胞生長的現象(圖1C)。

A.成纖維細胞；B.乳腺上皮細胞；C.酶消化法培養的細胞圖1 細胞形態觀察

2.2 乳腺上皮細胞的純化以上3種方法均可成功獲得乳腺上皮細胞，利用成纖維細胞和乳腺上皮細胞對Trypsin敏感性不同的特點，通過Trypsin消化使成纖維細胞先脫落，去除成纖維細胞，上皮細胞繼續貼壁培養，從而達到分離出乳腺上皮細胞的目的。如圖2A所示，純化獲得的乳腺上皮細胞形狀多為多邊形或卵圓形，少數呈短梭形，細胞連接緊密成片，總體呈多邊形。由于采取的組織正處在泌乳期，有些區域出現了脂滴空泡(圖2B)。1周后可見有些細胞外基質互相連接，出現了“拉網”現象(圖2C)。

A.純化的細胞；B.脂滴空泡；C.“拉網”初期圖2 純化的細胞形態

2.3 姬姆薩染色姬姆薩染色顯示，乳腺上皮細胞呈多邊形，細胞質著色較淺，細胞核大，呈不規則圓形，多數細胞有2～5個核仁，核仁明顯，著色較深(圖3)。

圖3 乳腺上皮細胞的姬姆薩染色

2.4 生長曲線通過3種不同方法所獲得細胞的生長曲線見圖4，其中組織塊法獲得的細胞生長速度最快，膠原酶消化結合組織塊法培養的細胞生長速度次之，酶消化法獲得的細胞生長速度最慢，生長曲線均呈“S”型，符合細胞增殖的生物學規律。從生長曲線上看，前3 d是細胞生長的潛伏期，此階段的細胞生長速度較慢；第3～6天是對數增長期，該階段的細胞生長速度很快，傳代適合在該階段進行；第6 天之后進入細胞生長的平臺期，細胞開始逐漸老化、凋亡。

圖4 3種不同方法所獲得細胞的生長曲線

2.5 乳腺上皮細胞的免疫熒光鑒定倒置熒光顯微鏡下觀察發現，細胞核被DAPI染成藍色，細胞膜上CK-18呈陽性，可見綠色熒光(圖5)。

A.細胞核呈現藍色熒光；B.細胞質呈現綠色熒光；C.細胞核和細胞質熒光疊加圖圖5 乳腺上皮細胞鑒定

2.6 RT-PCR法檢測β-酪蛋白的表達瓊脂糖凝膠電泳發現，3種方法獲得的細胞均可檢測到180 bp 的β-酪蛋白基因條帶(圖6)。

M.DL2000 DNA Marker；1.酶消化法；2.組織塊法；3.酶消化組織塊法圖6 不同方法獲得細胞的β-酪蛋白基因的RT-PCR檢測

2.7 LPS最適質量濃度的篩選由表1可知，10 mg/L LPS處理乳腺上皮細胞12 h對乳腺上皮細胞的促生長作用最強。

表1 LPS對乳腺上皮細胞增殖的影響(n=5)

2.8 10 mg/L LPS對乳腺上皮細胞IL-8和TNF-α分泌的影響由表2可知，LPS處理乳腺上皮細胞后12 h，10 mg/L LPS可以顯著提高IL-8和TNF-α的分泌量(P<0.01)。

表2 LPS對乳腺上皮細胞IL-8和TNF-α分泌的影響 (n=5) μg/L

2.9 LPS對乳腺上皮細胞TLR-4蛋白表達的影響由圖7可知，當LPS質量濃度為10 mg/L時，TLR-4的蛋白表達量最高。

圖7 LPS對乳腺上皮細胞TLR-4蛋白表達的影響

3 討論

目前國內外學者已成功培養出了多種動物的乳腺上皮細胞。培養的方法有組織塊法[5]、酶消化法[6]、乳汁分離法[7]、機械破碎法[8]等。本研究分別采用組織塊法、膠原酶消化組織塊法和酶消化法3種方法對乳腺上皮細胞進行了分離培養。酶消化法是使用Trypsin和膠原酶聯合消化后直接獲得細胞的方法，此方法用時短，采取的組織腺泡發育越好獲得的上皮細胞數目越多，缺點是會摻雜大量成纖維細胞，需要多次純化，且酶對細胞的損傷大。本研究采用酶消化法獲得的細胞中摻雜大量成纖維細胞，經過多次純化后細胞活力降低，培養至4～5代后細胞會逐漸凋亡，其原因可能是Trypsin消耗過程對細胞的損傷太大，不適合乳腺上皮細胞的分離[9]。組織塊法是3種方法中操作最簡單的方法，對細胞損傷小，但培養時間長，由于成纖維細胞比上皮細胞先從組織塊中遷出[10]，導致去除成纖維細胞時會損失部分上皮細胞，因此上皮細胞的收集較難[11-12]。酶消化組織塊法是聯合兩種方法的一種比較新的方法，該方法細胞遷出速度比組織塊法快，摻入的成纖維細胞比酶消化法少，而且，由于酶的使用濃度低，所以對細胞造成的損傷也比較小，所獲細胞的活性比較好[13]。由于組織塊法培養細胞周期長于酶消化組織塊法，所以酶消化組織塊法是最符合預期的乳腺上皮細胞分離方法。

本研究采用免疫熒光技術對細胞進行了鑒定。角蛋白是細胞骨架的組成成分，是上皮來源的組織標志物，廣泛地應用于多種動物乳腺上皮細胞的鑒定[14-15]，因而通過免疫熒光法檢測角蛋白可以鑒別乳腺上皮細胞。酪蛋白是動物乳汁蛋白的重要組成部分，β-酪蛋白是酪蛋白的主要形式，所以β-酪蛋白可以作為乳腺上皮細胞是否具有泌乳功能的重要指標[7,14-15]。本研究中β-酪蛋白基因在乳腺上皮細胞中的表達呈陽性，說明分離的細胞都具有合成乳蛋白的能力。

多數乳房炎是由革蘭陰性菌引起的，LPS位于革蘭陰性菌細胞壁的最外層，當菌體受到破壞或者裂解死亡后會釋放到周圍環境中，引發機體產生炎癥反應[16]。田青等[17]研究表明，LPS可以誘導大鼠乳腺上皮產生炎性反應；張馳等[18]也用LPS刺激牛乳腺上皮細胞成功構建了奶牛乳腺上皮細胞炎性模型。TLR-4是LPS激活炎癥信號通路的關鍵受體，當有炎癥發生時，TLR-4的蛋白表達量升高[19]。本研究以10 mg/L LPS刺激乳腺上皮細胞12 h后，TLR-4蛋白表達量最高。

將TNF-α和IL-8兩種炎癥早期分泌的細胞因子作為衡量炎性細胞模型是否構建成功的指標，10 mg/L LPS刺激乳腺上皮細胞后12 h TNF-α和IL-8的表達量顯著高于對照組，表明10 mg/L LPS作用12 h是構建乳腺上皮細胞炎性模型的適宜條件。