維甲酸對成肌細胞細胞周期進程及凋亡的影響

李成緒，馬 莉，連 帥，徐 彬，逯靜靜，李鑫月，李倩茹，楊煥民 (黑龍江八一農墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163000)

當骨骼肌受到損傷時，機體會自發地修復損傷，而成肌細胞的增殖和凋亡正是這一過程的關鍵。有研究表明，成肌細胞的增殖能夠影響其遷移和存活[1-2]，這說明，骨骼肌損傷的修復可能與成肌細胞的增殖有關。

早有研究表明，當骨骼肌處于損傷狀態時，骨骼肌細胞的生長和凋亡對其存活至關重要。一方面，當骨骼肌受到外力刺激時，其細胞內會觸發一系列反應，激活干細胞的分裂和分化，從而替代受損細胞，修復骨骼肌；另一方面，這種刺激也導致了骨骼肌的損傷，并提高了骨骼肌細胞的凋亡水平[3-4]，因此，抑制成肌細胞的凋亡與增殖能夠影響骨骼肌損傷的修復[5]。目前，在分子和細胞水平上同時研究骨骼肌細胞增殖和凋亡的報道較少。PING等[6]關于血管平滑肌的研究發現，抑制細胞凋亡和促進細胞增殖可以改善骨骼肌的生長，此研究確定了影響骨骼肌細胞增殖和凋亡的關鍵分子及它們之間的相互作用。

全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是維生素A代謝的中間體，有研究表明ATRA可誘導肢體畸形發育[7-9]。同時，ATRA也是骨發育的重要調節因子，可調控多種骨細胞的增殖和凋亡。本研究旨在闡明ATRA調控成肌細胞增殖和凋亡作用的分子機制，為肌肉損傷的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系與主要試劑本試驗所用C2C12細胞系購自北京北納生物公司；ATRA和DMEM培養基購自Sigma公司；Ccnd1、Ccnd2、Ccnd3、Ccne1、CDK2、CDK4、CDK6、Bax、Bcl-2、Caspase-3及Ki67抗體、HRP標記二抗購自Proteintech公司；EdU、MTS、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司。

1.2 C2C12細胞培養C2C12細胞用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素(Gibco，Rockville，MD，美國)的DMEM(Hyclone，Logan，美國猶他州)培養，培養條件為37℃，5% CO2。將細胞分為2組：第1組正常培養，記作對照組；第2組使用ATRA處理24 h，ATRA終濃度為100 nmol/L，記作ATRA組。

1.3 MTS分析按照MTS試劑盒說明書檢測C2C12細胞的增殖活性。接種C2C12細胞于96孔板，待其貼壁后，將培養液換為含有100 nmol/L ATRA的細胞培養液，處理45 h，向每孔細胞中加入20 μL MTS試劑，37℃孵育3 h。使用酶標儀檢測490 nm處的D值，每組至少重復3次。使用DMSO溶解ATRA，對照組添加相同濃度的DMSO。

1.4 細胞周期分析接種C2C12細胞于96孔板，待其貼壁后，向細胞中加入ATRA，使其濃度為100 nmol/L，45 h后收集細胞，在4℃的70%乙醇中固定12 h。隨后，用PBS洗滌細胞，用0.5 mL PI/RNase染色緩沖液(BD Biosciences，圣地亞哥，加利福尼亞，美國)在室溫下染色15 min，通過流式細胞儀分析細胞周期。

1.5 細胞凋亡檢測按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行試驗。用100 nmol/L ATRA處理C2C12細胞48 h，每組取1×105個細胞，加入195 μL結合液重懸，向細胞中加入5 μL AnnexinV-FITC，輕輕混勻后再加入10 μL PI染色液，孵育30 min。用流式細胞儀(Beckman，美國)檢測凋亡率。

1.6 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達提取細胞總蛋白并測定蛋白濃度，進行SDS-PAGE。將凝膠中的蛋白通過半干法電轉至PVDF膜上，于5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉1 h，隨后用以下一抗4℃孵育過夜：Ccnd1、Ccnd2、Ccnd3、Ccne1、CDK2、CDK4、CDK6、Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-actin(作為內參)，用TBST洗盡一抗，用HRP標記二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，用TBST洗滌5次，增強化學發光法成像，用Image Pro Plus 5.0軟件進行圖像分析。

2 結果

2.1 ATRA對C2C12細胞增殖活性的影響MTS結果表明，ATRA組的增殖活性顯著增強(圖1A)。同樣，Ki67(細胞增殖的標志物)免疫熒光染色及EdU檢測結果顯示，與對照細胞相比，用ATRA處理后，C2C12細胞的增殖活性顯著增強(圖1B，C)。

A.ATRA對C2C12細胞增殖活性的影響；B.C2C12細胞中Ki67表達的免疫熒光檢測；C.EdU分析測定C2C12細胞的增殖。**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下同圖1 ATRA對C2C12細胞增殖的影響

2.2 ATRA對C2C12細胞周期的影響檢測ATRA處理45 h對細胞周期蛋白D1(Ccnd1)、Ccnd2、Ccnd3、Ccne1和CDK2、CDK4、CDK6表達的影響。結果顯示，ATRA能夠顯著增加上述蛋白的表達水平(圖 2)，表明ATRA能夠促進C2C12細胞從G1期到S期的轉換，加快了細胞周期進程。

A.Western blot檢測ATRA對C2C12細胞周期相關蛋白表達的影響；B，C.Western blot檢測所得條帶的灰度值分析圖2 ATRA對C2C12細胞周期相關蛋白的影響

2.3 ATRA對C2C12細胞增殖進程的影響通過流式細胞術檢測ATRA對C2C12細胞增殖進程的影響。結果顯示，ATRA能夠提高C2C12細胞中處于S期細胞的比例，并降低處于G1期細胞的比例(圖 3)，表明ATRA能促進C2C12細胞的增殖。

A.ATRA處理對C2C12細胞增殖進程的影響；B.ATRA處理對不同時相C2C12細胞存活率的影響圖3 ATRA對C2C12細胞增殖進程的影響

2.4 ATRA對C2C12細胞的凋亡率及凋亡相關蛋白表達的影響檢測了ATRA對C2C12細胞凋亡水平的影響。如圖4A，B所示，ATRA降低了C2C12細胞的凋亡率。通過Western blot方法檢測C2C12細胞中凋亡相關蛋白的表達水平，如圖4C～F所示，與對照組相比，ATRA處理組的Bax表達水平及活化的Caspase-3顯著降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平升高，進一步證實了ATRA對C2C12細胞的抗凋亡作用。

A，B.流式細胞術檢測ATRA對C2C12細胞凋亡水平影響；C～F.Western blot 檢測凋亡因子Bcl-2、Bax及活化的Caspase-3蛋白質水平圖4 ATRA對C2C12細胞的凋亡狀態及相關蛋白表達的影響

3 討論

越來越多的研究證實骨骼肌的再生潛力主要歸因于成肌細胞增殖的激活[10]，然而肌細胞的凋亡對于骨骼肌損傷修復的影響仍然不能忽視。盡管已有關于影響骨骼肌再生的轉錄因子的研究[11]，但是維生素代謝產物對于成肌細胞的調控機制仍然未知。本研究發現ATRA在成肌細胞中調控增殖和凋亡，推測ATRA可能促進了骨骼肌的再生和修復。

ATRA是維生素代謝的重要環節，是一種分泌型的信號轉導分子，可誘導軟骨細胞增殖。有研究表明，向在軟骨中表達人類ATRA基因的轉基因小鼠腹腔注射BrdU，可誘導軟骨細胞增殖，并加速細胞周期從G1期到S期的轉變[12]。細胞周期受細胞周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶CDKs所調節[13]，D型細胞周期蛋白，包括Ccnd1、Ccnd2和Ccnd3，是哺乳動物細胞增殖的關鍵分子，與CDK4或CDK6一起調節細胞由G1期進入S期，Ccne1與CDK2也參與G1/S進程[14-15]。已有研究證明ATRA可以促進鹿茸軟骨細胞的增殖及分化[16]。本研究發現，ATRA顯著增加C2C12細胞中Ccnd1、Ccnd2、Ccnd3、Ccne1、CDK2、CDK4和CDK6的表達，同時使C2C12細胞的增殖顯著增強，這對骨骼肌細胞的生長至關重要。

細胞凋亡是維持機體穩態和正常發育的重要功能。有研究發現，ATRA可以通過抑制細胞凋亡調控各種腫瘤，如乳腺癌、骨癌、肝癌及肺癌等[17-18]。相反，ATRA的活性效應也可能是抑制細胞生長并誘導凋亡的結果。比如，ATRA可以誘發小鼠胚胎芽的凋亡進而使肢體畸形[19]。然而在本研究中，ATRA減少了成肌細胞的凋亡并降低了促凋亡因子Bax的表達及Caspase-3的活化，這可能與ATRA對成肌細胞增殖的促進作用有關。

綜上所述，本研究在細胞水平探討了ATRA影響成肌細胞增殖及凋亡的機制，證實了維生素代謝產物對骨骼肌損傷修復及再生中發揮的重要作用。這提示我們嘗試從維生素代謝產物的方面著手，尋找治療或預防人類和動物肌肉損傷的方法，并為骨骼肌細胞的發育和損傷修復提供理想模型。