一種表達eGFP的rAAV-SaCas9系統的構建及應用

趙憶甜，李秀青，王曉帆，高 峰，張坤朋，翁少亭,* (.河南農業大學 動物醫學院，河南 鄭州 450046；.安陽工學院 生命與食品工程學院，河南 安陽 455000)

CRISPR/Cas9技術是一種相對成熟，并且簡便易行的基因組定點編輯技術，是分子生物學研究和改善生物特性的常用技術[1-2]，該技術可用于制備轉基因動物[3-4]。ZHOU等[5]利用CRISPR/Cas9技術建立了敲除Park2和Pink1基因的細胞系，并用體細胞核移植的方法培育出了雙基因突變豬。HEO等[6]利用CRISPR/Cas9技術將eGFP序列通過同源重組的方法插入到牛多功能干細胞的Nanog基因中，使胚胎能表達出eGFP熒光蛋白。KIMURA等[7]利用CRISPR/Cas9技術對斑馬魚的基因進行了基因組定點編輯，通過顯微注射的方法將外源基因整合到胚胎的Evx2基因和Englb基因中。然而，轉基因動物有抗病能力弱、易癌變、繁殖障礙的缺點，不能被畜牧生產廣泛應用。因此需要一種既能改變家畜成體生產性能，又不影響家畜穩定遺傳的方法推進畜牧業產能的提升。利用CRISPR/Cas9技術對組織的基因組進行定點編輯是理想的方法，但是，在組織內進行基因組編輯受到多種因素的影響，包括載體的選擇、Cas9蛋白的編輯效率以及內部環境的影響等。CRISPR/Cas9的體內表達是通過流體動力學傳遞或病毒轉導實現的，其中病毒轉導常用腺病毒(Ad)或腺相關病毒(AAV)載體。以AAV作為Cas9的載體是一種很有潛力的基因組定點編輯工具[8]。CRUDELE等[9]利用該技術對遺傳性肌營養不良疾病的特定肌肉區域進行了基因編輯，改善了肌肉萎縮癥狀。然而，許多CRISPR/Cas9相關元件太大，超過AAV的容量限制(包括兩個ITR，約4.85 kb)。值得注意的是常用的化膿性鏈球菌Cas9(SpCas9)約為4.3 kb，與組合必需的基因調控元件結合后超過AAV的容量。克服這一障礙的一個方法是利用來自不同原核物種的較小的Cas9同源核酸酶，如嗜熱鏈球菌Cas9(St1Cas9)、腦膜炎奈瑟菌Cas9(NmCas9)和金黃色葡萄球菌Cas9(SaCas9)的核酸酶，都具有與SpCas9相似的酶切能力，由于它們都比SpCas9短約1 kb[10-12]，更有利于AAV的包裝。這一障礙也可以通過優化調控元件克服。MEFFERD等[13]報道，可以由小的tRNA啟動子(約70 bp)驅動sgRNAs的表達，其大小約為帶有U6啟動子的sgRNA表達盒的一半。TABEBORDBAR等[14]重建了一個新的AAV-SaCas9載體，由EF1α啟動子驅動SaCas9的表達。還有研究人員構建了pX601-miniCMV-SaCas9-U6-sgRNA載體，由只有39 bp的miniCMV啟動子驅動SaCas9的表達。改進的rAAV系統能夠容納Cas9蛋白、sgRNA以及其他可以提高rAAV組織嗜性、靶向性或進行熒光標記的調控元件[15]。

肌肉生長抑制素(myostatin，簡寫MSTN，又稱GDF8)是轉化生長因子β(TGF-β)信號蛋白超家族成員，是脊椎動物肌肉質量的重要調節因子,能抑制肌肉細胞的增殖和分化。MSTN功能障礙可促進肌肉生長，引發動物超級肌肉表型[16-17]。世界著名的比利時蘭牛和皮埃蒙特牛就是由于Mstn基因突變導致的“雙肌牛”。KIRK等[18]發現MSTN與成年動物肌肉萎縮和肌肉再生有關，它是次級肌纖維萎縮因子，再生的肌管部分MSTN含量極低。一系列研究表明，MSTN缺乏的家畜有背膘厚、生長快、飼料轉化率和瘦肉率高等優良生產性能。本研究構建了一個針對特定組織的rAAV-SaCas9-eGFP基因編輯系統，該系統能通過eGFP在體內的表達間接了解rAAV-SaCas9-eGFP的存在時間以及在組織中的分布。此外，通過該系統敲除小鼠肌肉中的Mstn基因，可以有效地增加肌肉細胞的數量和體積，為培養高產肉用型家畜提供參考。

1 材料與方法

1.1 質粒、感受態細胞、細胞和實驗動物pX601(pX601-CMV:SaCas9-U6:sgRNA)、pLentiCRISPR V2、th-P2A-eGFP、pAAV9-RC和pHelper由河南農業大學動物分子生物技術實驗室保存；TOP10感受態細胞由河南農業大學動物分子生物技術實驗室制備；HEK293T細胞由河南農業大學動物分子生物技術實驗室提供；8周齡C57BL/10雄性小鼠由河南農業大學動物分子生物技術實驗室飼養。

1.2 試劑ClonExpressⅡ一步克隆試劑盒為南京諾唯贊生物科技有限公司產品；KpnⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、AgeⅠ、BamHⅠ、BbsⅠ、T7核酸內切酶Ⅰ為NEB(北京)有限公司產品；胎牛血清(FBS)、DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、RIPA裂解緩沖液為賽默飛世爾科技(中國)有限公司產品；PEI轉染試劑為Sigma試劑公司產品；PEG8000、氯化銫、透析袋為源葉生物科技有限公司產品；組織和細胞基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產品；SYBR Green 染色液為莊盟生物科技有限公司產品；兔多克隆抗MSTN、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔抗體為北京博奧森生物技術有限公司產品。

1.3 psgMstn載體的構建所有質粒均采用標準重組DNA克隆技術構建。tRNAGLN和sgRNA骨架序列(5′-GGTTCCATGGTGTAATGGTTAGCAC-TCTGGACTCTGAATCCAGCGATCCGAGTTC-AAATCTCGGTGGAACCT-GAAACACCGGAG-ACCACGGCAGGTCTCAGTTTTAGTACTCTG-GAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAA-TGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCG-AGA-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用引物tRNAGLN-F:5′-AGGCATGCTGGGGAGGTACCGGTTCCATGGTGTAATGGTT-3′，Scaf-R:5′-CTAGGGGTTCCTGCGGCCGCAAAA-ATCTCGCCAACAAGTTG-3′擴增合成序列，用ClonExpressⅡ一步克隆試劑盒將其克隆至被KpnⅠ和NotⅠ酶切后的pX601-CMV:SaCas9-U6:sgRNA中。將構建的載體轉化進TOP10感受態細胞，通過測序鑒定篩選出含有質粒pX601-CMV:SaCas9-tRNA:sgRNA的菌株，擴大培養并提取質粒。用引物EF1α-F:5′-CCTGCGGCCTCTAGAC-TCGAGGTGGGCAGAGCGCACATCGC-3′，EF1-α-R:5′-TGGGGCCATGGTGGCACCGGTCCTGTGTTCTGGCGGCAAAC-3′從pLentiCRISPR V2載體中擴增出EF1α啟動子,然后，在緊鄰pX601-CMV:SaCas9-tRNA:sgRNA SaCas9基因的XhoⅠ和AgeⅠ位點酶切，并用ClonExpressⅡ一步克隆試劑盒將EF1α啟動子插入其中，獲得pX601-EF1α:SaCas9-tRNA:sgRNA。利用引物P2A-eGFP-F：5′-CCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGCTACTAATTTCTCCT-3′，P2A-eGFP-R：5′-ATCTG-GAACATCGTATGGGTCTTGTACAGCTCGTC-3′從th-P2A-eGFP供體中擴增出P2A-eGFP基因，用ClonExpressⅡ一步克隆試劑盒將P2A-eGFP基因克隆到BamHⅠ酶切后的pX601-EF1α:SaCas9-tRNA:sgRNA載體，獲得pX601-EF1α:SaCas9-eGFP-tRNA:sgRNA，其結構如圖1所示。寡核苷酸sgMstn-F:5′-CACCGAAACAATCATTACCATGCCTA-3′，sgMstn-R:5′-AAACTAGGCATGGTAATGATTGTT-TC-3′經退火反應形成雙鏈，將之插入到pX601-EF1α:SaCas9-eGFP-tRNA:sgRNA的BbsⅠ位點，構建出質粒pX601-EF1α:SaCas9-eGFP-tRNA:sgMstn(縮寫為psgMstn)。

1.4 rAAV9-eGFP-sgMstn病毒的包裝與純化為了包裝rAAV9-eGFP-sgMstn病毒，將HEK293T細胞以5×106個/皿密度接種于100 mm細胞培養皿，添加含10%FBS的DMEM培養基，37℃、5% CO2條件下培養。細胞長至50%～60%融合后，按照PEI轉染試劑說明書，將psgMstn、pAAV9-RC和pHelper 3個質粒共轉染細胞，轉染后8 h更換新鮮DMEM培養基，轉染后96 h，將細胞刮入培養基后統一收集到50 mL離心管中， 1 000×g離心10 min，收集上清到另一50 mL 離心管，將細胞重懸于5 mL的PBS中，在-80℃和37℃下對細胞懸浮液反復凍融3次，釋放細胞內病毒。離心后取上清用0.22 μm過濾器過濾，收集細胞過濾液與之前的上清混勻，用PEG8000濃縮，通過氯化銫密度梯度柱進行純化。經過兩輪超速離心，分離并收集高密度病毒，通過透析袋脫鹽后置于-80℃備用。將質粒pX601從1×1011拷貝/μL稀釋至1×104拷貝/μL 作為標準品溶液，利用引物ITR-QPCR-F:5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′，ITR-Q-PCR-R:5′-AGGAACCCCTAGTGATG-3′，通過RT-PCR方法測定純化的rAAV9-eGFP-sgMstn的病毒滴度[19]。

1.5 rAAV9-eGFP-sgMstn在肌肉組織特定位點的表達AAV9對肌細胞具有嗜性強，有利于細胞內的基因編輯，常被應用于肌肉組織。將15只C57BL/10雄性小鼠分為3組，5只/組，在第1試驗組小鼠左側大腿股四頭肌注射50 μL(5×1010vg)rAAV9-eGFP-sgMstn；在第2試驗組小鼠左側大腿內收肌注射50 μL(5×1010vg)rAAV9-eGFP-sgMstn；對照組小鼠的左側大腿兩處肌肉各注射50 μL PBS。在第8周處死小鼠，觀察大腿肌肉中eGFP熒光的表達與分布。

1.6 肌肉組織注射rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠大腿肌肉質量的影響將30只C57BL/10雄性小鼠分為2組， 15只/組，試驗組小鼠左側大腿肌肉分3個點注射100 μL(1×1011vg)rAAV9-eGFP-sgMstn，對照組小鼠左側大腿肌肉分3個點注射100 μL PBS。在第6,8,10周，每周處死5只小鼠，用熒光成像系統檢測組織熒光的表達。取肌肉分別進行基因組DNA提取、總蛋白提取和肌肉組織固定。

1.7 T7核酸內切酶1(T7E1)裂解分析根據組織和細胞DNA提取劑盒說明書提取肌肉組織基因組DNA。以純化的基因組DNA為模板，用特異性引物Mstn-Test-F:5′-CGCCTGGAAACAGCTCCT-AA-3′，Mstn-Test-R:5′-TCTCA TGCTTTAACACTGCCT-3′擴增Mstn基因片段，擬擴增片段大小為521 bp。PCR產物用T7E1裂解，裂解產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用SYBR Green 染色液孵育1 h，用凝膠成像系統拍照。用 Imge J 定量軟件計算 Indel 率，公式為：indel(%)=100%×(1-√1-f(cut))，f(cut)=(a+b)/(a+b+c)，a 和 b 表示切割產生的新條帶的灰度值，c 表示未被切割條帶的灰度值。

1.8 蛋白免疫印跡分析將部分股四頭肌組織勻漿后加入500 μL RIPA裂解緩沖液(50 mmol/L TrisHCl，pH8.0，150 mmol/L NaCl，1% TritonX-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉和2 mmol/L MgCl2)，在冰上用注射器對混合物吸吹30次以上，4℃ 10 000×g離心20 min去除細胞碎片，收集上清液。用BCA法測定蛋白濃度，在樣品中加入6 ×上樣緩沖液(2.7 mol/L尿素、3.3%十二烷基硫酸鈉和0.167 mol/L Tris，pH6.7)在100℃下加熱10 min。用10% SDS-PAGE凝膠分離30 μg 蛋白樣品，然后轉移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中孵育1 h后，將膜與兔抗MSTN、兔抗GAPDH多克隆抗體(1∶1 000)在4℃下孵育過夜，洗凈一抗后，加入HRP標記的山羊抗兔抗體(1∶2 000)，于室溫下孵育1 h。目的蛋白用Luminata Crescento免疫印跡HRP底物檢測。

1.9 組織學分析用10%多聚甲醛固定分離的股四頭肌和內收肌，石蠟包埋后做成組織切片，用蘇木精和伊紅染色切片[20]。每組分別在放大倍數為40×，200×的視野下分析至少5個位點，計算出單個肌細胞的平均橫截面積(μm2)。所有數據均用Image Proplus 6.0軟件進行分析。

1.10 小鼠肌肉質量注射rAAV9-eGFP-sgMstn后10周，分別取各組小鼠左側大腿的股四頭肌和內收肌，測其質量并記錄。

2 結果

2.1 CRISPR/SaCas9載體的構建重點構建了pX601-EF1α:SaCas9-eGFP-tRNA:sgRNA載體用于包裝rAAV9-eGFP-sgMstn，該載體通過EF1α啟動子控制SaCas9和eGFP的表達，SaCas9通過自切割序列P2A與eGFP相連,通過tRNA啟動子控制sgRNA表達。P2A序列使SaCas9和eGFP能夠從同一順反子中產生兩個獨立的具有功能的蛋白，可通過eGFP蛋白的表達間接了解rAAV的轉導效率和SaCas9介導的基因編輯(圖1)。

圖1 包含EF1α:SaCas9-eGFP-tRNA:sgRNA的SaCas9/CRISPR系統構建示意圖

2.2 rAAV9-eGFP-sgMstn在肌肉組織特定位點高效表達eGFP,通過eGFP評估rAAV9-eGFP-sgMstn在肌肉組織特定位點是否表達。結果發現,在試驗1組和試驗2組中，分別在小鼠左側的股四頭肌和內收肌中可見明顯的綠色熒光，在周圍組織中未見熒光。在對照組小鼠左側的對應肌肉中未觀察到綠色熒光(圖2)，表明rAAV9-eGFP-sgMstn在體內肌肉細胞中成功表達，并且只存在于注射的特定部位，沒有擴散至其他組織。這一結果為后續肌肉組織細胞的基因編輯試驗做好了rAAV有效性及安全性驗證。

CN.注射PBS的對照組；EG-1.股四頭肌注射rAAV9-eGFP-sgMstn的試驗1組；EG-2.內收肌注射rAAV9-eGFP-sgMstn的試驗2組圖2 小鼠肌肉特定位點的eGFP表達

2.3 rAAV9-eGFP-sgMstn在小鼠大腿肌肉中長期穩定表達通過熒光成像系統觀察到，從第6周開始，在試驗組小鼠大腿肌肉能檢測到明顯的綠色熒光，并且一直持續至第10周，綠色熒光隨著時長的增加呈現遞增的趨勢，而對照組小鼠大腿肌肉始終沒有熒光表達(圖3)，說明試驗組中rAAV9-eGFP-sgMstn可在小鼠肌細胞中持續穩定表達，并且在一定時間范圍內該重組病毒的表達量隨著時間的增加而增加。

注：圖像范圍為2×1010～5×1010 photons/(s·cm2)；采取背側位置進行熒光成像；CN為對照組圖3 eGFP在小鼠肌細胞中持續穩定表達

2.4 rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠肌細胞的基因編輯通過T7酶切鑒定法檢測對Mstn基因片段的編輯效率，結果顯示，Mstn基因片段的大小為521 bp，試驗組中目的片段下有長度分別為181,340 bp的2個條帶，而對照組中則沒有這兩條帶(圖4A)。通過對條帶的灰度分析得出試驗組的正常Mstn片段的相對含量為79.17%，其基因編輯效率為20.83%(圖4B)。此外，Western blot結果顯示，與對照組相比，試驗組小鼠肌肉中MSTN蛋白水平明顯降低(圖4C)，對蛋白條帶的灰度進一步分析得出試驗組MSTN蛋白相對表達量為47.95%(圖4D)。結果表明，rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠肌細胞中的Mstn基因進行了有效地編輯并影響了MSTN蛋白的表達。

A.T7酶切鑒定法檢測基因編輯(M.50 bp DNA Marker；CN.對照組；1～4.試驗組)；B.Mstn基因的相對表達量(CN.對照組；KO.試驗組)； C.MSTN蛋白免疫印跡分析(CN.對照組；1～4.試驗組)；D.MSTN蛋白的相對表達量(CN.對照組；KO.試驗組)。*.0.01

2.5 rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠肌肉性狀的影響觀察小鼠肌肉組織切片發現，與對照組相比，試驗組小鼠股四頭肌和內收肌顯著增大，肌細胞數量也明顯增加(圖5A)。此外，通過對每組小鼠的股四頭肌和內收肌測定質量，發現試驗組小鼠股四頭肌和內收肌的平均質量明顯高于對照組(圖5B)。這些結果表明，肌肉組織注射rAAV9-eGFP-sgMstn可使單位面積內肌細胞數量增多，并且使肌肉質量增加。

A.股四頭肌和內收肌切片蘇木精和伊紅染色(HE)結果(CN.對照組；KO.試驗組；比例尺.200 μm)；B.10周時各組小鼠股四頭肌和內收肌的質量(CN.對照組；KO.試驗組)圖5 rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠肌肉性狀的影響

2.6 rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠肌肉質量的影響小鼠肌細胞切片發現，試驗組小鼠股四頭肌和內收肌細胞橫截面積比對照組明顯增大(圖6A)。其中試驗組小鼠股四頭肌細胞的平均橫截面積為7 806 μm2，內收肌細胞的平均橫截面積為7 315 μm2。而對照組小鼠股四頭肌細胞的平均橫截面積為5 882 μm2，內收肌細胞的平均橫截面積為4 985 μm2，表明rAAV9-eGFP-sgMstn使小鼠肌細胞橫截面積增大(圖6B)。

A.股四頭肌和內收肌切片蘇木精和伊紅染色(HE)顯示肌細胞的橫截面(CN.對照組；KO.試驗組；比例尺.50 μm)；B.各組小鼠股四頭肌和內收肌細胞的橫截面積(CN.對照組；KO.試驗組。數據用單因素方差分析進行分析)圖6 rAAV9-eGFP-sgMstn對小鼠肌細胞的影響

3 討論

目前rAAV-SaCas9系統已被證實能在體內進行定點基因編輯[12]，而且該系統有與SpCas9系統類似的編輯效率。因此，rAAV-SaCas9系統可能被用來編輯特定部位的基因，以改善組織特性和治療慢性病[21-22]。本研究構建了一個具有不同sgRNA啟動子(tRNA promoter，72 bp)和SaCas9啟動子(EF1α promoter，212 bp)的SaCas9系統，該系統可以僅通過一種rAAV傳遞到細胞中介導基因組編輯。

由于AAV血清型、病毒滴度和注射方法的不同，AAV在組織中介導的基因編輯效率是不同的[23]。本試驗選用9型AAV進行肌肉注射是因為9型AAV對肌肉組織有高度嗜性，病毒利用度更高，因此對特定位點的基因編輯效果更好。在試驗中發現，將rAAV9-eGFP-sgMstn系統注入小鼠大腿肌肉后，eGFP的表達僅限于該區域內，沒有發生病毒在周圍組織的擴散。而且在一定時間內，rAAV9-eGFP-sgMstn作用時間越長，eGFP的熒光強度越高。因此，通過eGFP表達能間接得知病毒的感染量和SaCas9的基因編輯效果。

越來越多的研究證實，成肌細胞增殖隨MSTN水平的升高而降低，通過降低或抑制MSTN活性能加速細胞周期，促進成肌細胞的增殖。THOMAS等[24]和JOULIA等[25]發現MSTN上調細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑的活性和水平，從而阻止細胞由G1期向S期的轉變，抑制肌肉細胞的增殖，并減少肌肉纖維的數量。MCPHERROR等[26]通過基因敲除技術構建了Mstn基因突變純合體小鼠，發現在Mstn突變小鼠中，肌肉纖維的數量比野生型小鼠多86%，表明Mstn基因敲除導致肌肉纖維增殖和肥大。JI等[27]將Mstn基因敲除鼠與野生型進行比較，發現Mstn基因敲除后小鼠脂肪含量減少。所以，對家畜的Mstn基因進行敲除能提高家畜產肉性能和瘦肉率。本研究通過核酸及蛋白分析證明，構建的rAAV9-eGFP-sgMstn系統可對大腿肌肉細胞Mstn進行有效編輯。此外，該系統通過敲除Mstn基因顯著改善肌肉質量和體積，為該系統應用于畜牧業生產奠定了基礎。

綜上所述，本研究構建的rAAV9-eGFP-sgMstn系統可在體內穩定表達，而且只在注射的特定位點進行表達并對Mstn基因進行編輯，導致肌肉質量和肌細胞體積顯著增大，表明rAAV9-eGFP-sgMstn系統在提高家畜生產性能方面具有巨大的潛力。