口蹄疫病毒樣顆粒誘導的肥大細胞活化對IgG應答的影響

劉佳歡,崔 川,張俊娟,韓偉建,張義明,李麗敏,王家鑫 (河北農業大學 動物醫學院，河北 保定 071000)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)所引起的一種熱性、急性和高度接觸性偶蹄類動物傳染病[1]，目前預防FMD的主要措施是疫苗接種。雖然滅活疫苗在臨床上廣泛使用，但滅活疫苗接種1次后不能誘導持續的保護性免疫應答，而需要多次接種，且只能預防臨床疾病而不能阻止持續性感染，其生產過程中還存在安全隱患[2-4]。病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)是一種無致病性的蛋白質顆粒，不含核酸，極易被免疫細胞捕獲誘導機體產生較強的體液免疫和細胞免疫應答，因此VLP被廣泛用于新型疫苗的研發[5]。

肥大細胞(mast cells， MCs)廣泛分布于小血管和淋巴管周圍的結締組織內，與樹突狀細胞(dendritic cell，DC)、巨噬細胞等一起構成機體抗病原入侵的第一道防線[6-7]。作為組織內的免疫細胞，MCs不僅參與炎癥反應和纖維化，也發揮組織維持、血管生成、病原體清除和免疫調節的作用[8]。MCs通過其表面的模式識別受體識別細菌、寄生蟲與病毒結構蛋白，從而引發MCs活化，釋放預先形成的顆粒成分(組胺、蛋白酶等)、新合成的脂質介質和細胞因子，從而調節固有免疫及適應性免疫應答[9-11]，發揮其清除病原的重要作用[12-13]。MCs分泌的肝素和TNF-α與殼聚糖按一定的比例混合制成顆粒作為佐劑，與流感病毒血凝素混合制成試驗疫苗，用其免疫小鼠可有效模擬MCs的功能，從而誘導機體產生免疫應答抵抗致死量流感病毒的攻擊[14]。MCs活化后可以誘導機體血清中IgG水平顯著升高[15]，表明MCs的活化產物可以誘導機體產生較好的體液免疫應答。小鼠腹腔MCs在體外可以通過清道夫受體、甘露糖受體、TLR2和TLR4識別FMDV-VLP，從而引起脫顆粒和細胞因子的分泌[16-17]。特別值得注意的是，FMDV-VLP誘導的腹腔MCs脫顆粒產物可以促進脾初始淋巴細增殖，而其分泌成分則可以直接啟動脾初始B淋巴細胞增殖，從而抑制T淋巴細胞增殖[18]，但對于FMDV-VLP誘導機體皮膚、淋巴結、脾等器官內MCs脫顆粒的作用尚不清晰。

因此，本研究制備了FMDV-VLP，用其免疫小鼠[16]，利用冰凍切片技術研究小鼠組織中的MCs脫顆粒情況，通過ELISA方法檢測小鼠外周血中FMDV特異性IgG水平及TNF-α、IL-10分泌情況，以期為研究FMDV新型佐劑及免疫應答機制提供理論基礎與支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡的SPF級 BALB/c 小鼠(合格證書編號：11400700272257)購自北京維通利華實驗動物有限公司，飼養在獨立通風鼠籠中。

1.2 主要試劑HEK-293T細胞和重組質粒pET32a(+)-HBcAg(+)-VP1-VP4由本實驗室保存；無內毒素質粒提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司(CWS008)；BL21感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司(CD201-01)；Lipofectamin 2000 Reagent購自美國Invitrogen(11668030)公司；Opti-MEMⅠ無血清培養基(11058021)和DMEM高糖培養基(10373017)購自美國Gibco公司；超濾管購自Millipore公司(UFC500396)；碳支持膜300目圓孔銅網購自新興百瑞技術有限公司(T200)；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(PW0072)和2%磷鎢酸染色液(PR0124844)購自北京雷根生物技術公司；甲苯胺藍染色液試劑盒購自索萊寶科技有限公司(G3661)；小鼠TNF-α(MTA00B)和IL-10(M1000B)定量ELISA檢測試劑盒均購自美國R&D Systems公司；山羊抗小鼠HRP-IgG抗體購自中杉金橋生物技術有限公司(ZB-2035)；新西蘭胎牛血清購自Thermo Fisher Scientific公司(16140063)。

1.3 病毒樣顆粒的制備及Western blot鑒定將重組質粒pET32a(+)-HBcAg(+)-VP1-VP4轉化至BL21感受態細胞，過夜培養后通過無內毒素質粒提取試劑盒提取質粒。按照Lipofectamin 2000操作說明，將質粒與Lipofectamin 2000混合并轉染HEK-293T細胞，收集轉染后60 h的培養上清， 利用His標簽鎳離子蛋白純化柱純化目的蛋白。取純化后的蛋白，加入等體積2×SDS上樣緩沖液，振蕩混勻后，100℃水浴5 min使蛋白質變性，12 000 r/min離心2 min收集蛋白進行SDS-PAGE，電泳后對純化的蛋白進行Western blot鑒定。

1.4 VLP的透射電鏡鑒定在超濾管中加入200 mg/L FMDV VLP溶液200 μL，然后加入10 mL 經過0.22 μm濾膜過濾的超純水，濃縮至1 mL，重復3～4次，最后1次濃縮至200 μL。取20 μL濃縮液滴至透射電鏡銅網上，干燥后用2%磷鎢酸進行負染色，自然干燥后通過透射電鏡觀察。

1.5 動物試驗將20只BALB/c小鼠隨機分為2組。初次免疫采用頸背部多點注射方式，50 μg/只，注射劑量為0.2 mL(VLP組)；對照組小鼠注射同劑量PBS(PBS組)。首免后14 d進行加強免疫，VLP組和PBS組的免疫劑量和途徑均相同。對免疫后14，28 d的小鼠進行眼球采血，分離血清保存備用；頸椎脫臼法處死小鼠，分別取脾臟、頜下淋巴結、頜下腺和皮膚，浸泡于4%多聚甲醛中，室溫保存備用。

1.6 MCs染色將上述組織在30%蔗糖的PBS中過夜脫水處理，用OTC包埋劑進行包埋，用-20℃恒溫冰凍切片機切成4 μm厚度的組織切片，用4%多聚甲醛固定后使其自然干燥；使用甲苯胺藍浸染組織切片10～15 min(具體的染色時間根據切片的厚度和組織不同而定)；染色后用蒸餾水輕輕沖洗，用0.5%冰乙酸分化切片，直到細胞核和顆粒清晰可見；用95%乙醇和無水乙醇使組織切片快速脫水，經二甲苯透明后用中性樹膠封固組織切片。光學顯微鏡下隨機觀察5個視野，統計MCs及其脫顆粒狀況。

1.7 細胞因子檢測使用 ELISA定量檢測試劑盒分別測定小鼠血清中TNF-α和IL-10水平，具體操作方法按照說明書進行。每孔加入50 μL Assay Diluent RD1-63或Assay Diluent RD1W，再加入50 μL 標準品、樣品，室溫孵育2 h；每孔加入400 μL洗液，除去殘液，總共洗滌5次；每孔加入100 μL Mouse TNF-α Conjugate或Mouse IL-10 Conjugate，室溫孵育2 h；洗滌5次，加入100 μL Substrate Solution，避光室溫孵育30 min；加入100 μL Stop Solution，測定各孔D450 nm與D570 nm值。

1.8 FMDV特異性抗體檢測采用間接ELISA方法檢測血清中FMDV特異性IgG抗體。用VP1蛋白包被96孔板底部，4℃過夜；PBST洗滌3次后，用封閉液 (5%脫脂牛奶,PBS配制) 37℃封閉1 h；加入血清樣本，37℃孵育1 h；加入山羊抗小鼠HRP-IgG抗體，37℃孵育1 h；加入TMB底物，孵育后終止，測定各孔D450 nm值。

1.9 統計學處理將細胞因子ELISA試驗所獲得數據用ELISACalc軟件繪制標準曲線并對結果進行分析。使用GraphPad Prism 6.0 繪圖并使用Two-way ANOVA 方法進行統計學分析。

2 結果

2.1 FMDV-VLP的Western blot鑒定結果如圖1A所示，在約47 kDa處出現1條蛋白條帶，與預期大小相符；將蛋白轉膜后通過Western blot鑒定，在47 kDa處可見特異性條帶，與預期大小相符，表明純化的蛋白為FMDV-VLP(圖1B)。

A.FMDV VLP的SDS-PAGE結果(M1.蛋白Marker；1.純化前的轉染后60 h細胞培養上清；2.純化后的轉染后60 h細胞培養上清)。B.FMDV VLP的Western blot鑒定結果(M2.蛋白Marker；3.純化后的轉染后60 h細胞培養上清)圖1 FMDV VLP的SDS-PAGE分析和Western blot鑒定

2.2 FMDV-VLP的透射電鏡鑒定結果如圖2所示，FMDV-VLP直徑大約為30 nm，表明FMDV VP1-VP4 可以通過乙肝病毒核心抗原自組裝成FMDV-VLP。

圖2 FMDV-VLP的透射電鏡觀察結果

2.3 FMDV-VLP誘導小鼠MCs脫顆粒的觀察對小鼠皮膚、頜下淋巴結、脾臟和頜下腺切片的甲苯胺藍染色(圖3，4)顯示，14 dpi，MCs主要分布在表皮的小血管周圍結締組織中，并且VLP組MCs明顯脫顆粒，基本處于完全活化狀態；28 dpi，VLP組MCs在皮下組織中開始增多，且脫顆粒的MCs有增多的趨勢。在頜下淋巴結中，MCs主要分布在被膜下竇、副皮質區和髓質中；PBS組髓質中MCs非常少；14 dpi，VLP組髓質中MCs脫顆粒數量增多但不聚集，呈現分散狀態；而28 dpi，VLP組髓質中MC脫顆粒數量增多且呈聚集狀態。在脾臟中，MCs主要分布在脾索、脾竇及邊緣區，在被膜上和小梁內未見MC分布，且脾竇中MCs脫顆粒數量有從PBS組至VLP組，從14～28 dpi有增多的趨勢。在頜下腺中，MCs散在分布于腺泡和腺導管周圍，且MCs脫顆粒數量亦有從PBS組至VLP組，從14～28 dpi 有增多的趨勢。以上結果表明，FMDV-VLP可在體內誘導小鼠MCs脫顆粒，由于接觸抗原的時間順序不同，在14 dpi，VLP組皮膚中主要是表皮內的MCs脫顆粒，而淋巴結中則主要是被膜下竇的MCs脫顆粒；在28 dpi，在VLP組皮膚中，主要是皮下組織中的MCs脫顆粒，而在淋巴結中，則主要是深層髓質的MCs脫顆粒。

注：箭頭指向MCs；VLP組左側一列為200倍放大的小鼠組織，右側一列為400倍放大的小鼠組織；PBS組左側一列為200倍放大的小鼠組織，右側一列為400倍放大的小鼠組織圖3 14 dpi組織中MCs甲苯胺藍染色結果

注：箭頭指向MCs； VLP組左側一列為200倍放大的小鼠組織，右側一列為400倍放大的小鼠組織；PBS組左側一列為200倍放大的小鼠組織，右側一列為400倍放大的小鼠組織.圖4 28 dpi組織中MCs甲苯胺藍染色結果

用甲苯胺藍對組織切片染色，在光學顯微鏡下隨機選取5個視野統計MCs的數量，用GraphPad Prism 6.0軟件做圖并進行統計。如圖5顯示，14 dpi VLP組的皮膚(P<0.01)、淋巴結(P<0.01)和脾臟(P<0.05)中MCs脫顆粒的數目均顯著高于14 dpi PBS組，而14 dpi VLP組的頜下腺與14 dpi PBS組無顯著性差異。28 dpi VLP組的皮膚、淋巴結、脾臟MCs脫顆粒的數目均極顯著高于28 dpi PBS組(P<0.01)，而28 dpi VLP組的頜下腺亦顯著高于28 dpi PBS組(P<0.05)。結果表明，FMDV VLP可以誘導皮膚、淋巴結、脾臟和頜下腺中的MCs 脫顆粒，特別是皮膚和淋巴結的MCs；加強免疫后，VLP可以顯著提高皮膚和脾臟內MCs活化水平(P<0.01)。

注：活化既包含體積變大的MCs和正在脫顆粒的細胞，又包括已經脫顆粒細胞質空泡化的MCs。***表示P<0.001；**表示P<0.01； *表示P<0.05；下同圖5 小鼠組織MCs活化數量統計圖

2.4 血液細胞因子檢測采用ELISA法檢測小鼠血清中TNF-α與IL-10水平，如圖6所示，無論是初次免疫后還是再次免疫后，VLP組血清中TNF-α水平均顯著高于對照組(P<0.05)，而IL-10 水平無論是初次免疫后還是再次免疫后VLP組均與對照組沒有統計學差異(P>0.05)。

圖6 小鼠血清中TNF-α和IL-10水平

2.5 血清中FMDV-VLP特異性IgG檢測用間接ELISA法檢測血清中FMDV特異性IgG抗體，如圖7所示，在14 dpi，試驗組血清FMDV特異性 IgG呈陰性，而在28 dpi，試驗組血清 IgG呈陽性，且顯著高于14 dpi試驗組的血清IgG水平。結果表明，加強免疫FMDV-VLP可以誘導機體產生良好的IgG免疫應答。

注：- -表示陰性和陽性的臨界值圖7 小鼠血清中FMDV特異性IgG抗體水平

3 討論

MCs主要分布在皮膚、胃腸道以及鼻黏膜等病原微生物初次接觸機體的場所，在抗細菌、抗寄生蟲、抗病毒感染方面發揮重要作用[19-21]。MCs可通過其表面表達的多種模式識別受體識別病原微生物及其結構蛋白，引發自身活化，分泌預先儲存的或新合成的顆粒，從而調節免疫應答，這對于科學設計FMDV 新型疫苗及正確使用FMDV 疫苗具有積極的指導意義。

已有的研究表明，FMDV-VLP可以誘導小鼠腹腔MCs(pMCs)脫顆粒，該過程由TLR2介導[16]。梁慧婷等[18]發現FMDV-VLP 刺激PMCs可引起明顯的脫顆粒，pMCs脫顆粒產物對脾總淋巴細胞的增殖具有一定的促進作用。目前，關于MCs負載FMDV-VLP后脫顆粒水平的研究主要基于pMCs，并且是建立在體外模型的基礎上。本研究對FMDV-VLP誘導小鼠體內組織MCs應答效應進行分析，試驗結果顯示，FMDV-VLP可以誘導皮膚、淋巴結、脾臟和頜下腺中的MCs 脫顆粒，且加強免疫后VLP可以顯著提高皮膚和脾臟內MCs活化水平，這一發現將有助于進一步探究VLP對DC遷移和IgG形成的作用。

本研究發現FMDV-VLP刺激機體后TNF-α分泌顯著升高，IL-10分泌無影響，且加強免疫后FMDV-VLP可以誘導小鼠體內組織中的MCs脫顆粒，VLP組皮膚、頜下淋巴結、脾臟和頜下腺內MCs的脫顆粒現象明顯強于對照組。這一結果提示，如果有病原侵入皮膚，MCs會迅速作出應答。研究證實，MCs活化后可以促進DC和淋巴細胞向引流淋巴結遷移[15]，而加強免疫后淋巴結中脫顆粒的MCs增多，意味著其促進其他部位DC向淋巴結遷移的可能性增大，這對于啟動抗FMDV適應性免疫應答可能會起到十分積極的作用。脾臟主要應對血源性病原微生物，而皮下注射50 μg FMDV-VLP不一定能進入脾臟，所以脾臟MCs脫顆粒現象沒有皮膚和淋巴結明顯。MCs活化后可以分泌多種細胞因子和活性物質，在免疫調節方面發揮重要作用[22-23]，這使得MCs活化劑或MCs脫顆粒產物表現出一定的免疫佐劑潛力。研究顯示，MCs活化后可以誘導機體產生高水平的抗原特異性血清IgG[15]，而這種現象的產生與MCs脫顆粒成分密切相關，其可以招募DC和淋巴細胞向引流淋巴結遷移，從而誘導機體產生高水平的體液免疫應答。本研究結果證明,小鼠免疫FMDV-VLP后可以引起組織中MCs活化，同時誘導機體產生較強的IgG應答，這為進一步探究FMDV-VLP在體內引起的免疫應答機制提供了理論基礎。

本研究首次在體內探究了FMDV-VLP對鼠MCs脫顆粒的影響，表明VLP可以誘導組織內MCs脫顆粒，促進機體分泌TNF-α，并產生較強的IgG應答，提示MCs脫顆粒產物在誘導小鼠機體產生IgG應答方面可能發揮促進作用。在后續試驗中，我們將結合MCs脫顆粒成分可以有效輔助VLP誘導機體產生免疫應答的現象，開發可以與VLP共同應用的免疫佐劑，為VLP疫苗新型佐劑的研發提供新思路與新方法。