山羊源海藻糖比伯斯坦桿菌(Bibersteinia trehalosi)鐵結合蛋白A的原核表達與結構預測分析

張疏桐，田 鑫，胡天豪，孫筱峰，張 耕，程方俊，羅獻梅，宋振輝,2*，郭建華,2* (.西南大學 動物醫學院，重慶 402460；2.西南大學 醫學研究院 免疫學研究中心，重慶 402460)

鐵在動物機體生命活動中扮演著重要的角色，參與電子傳遞、DNA合成、氧氣運輸等重要的生命活動，是血紅蛋白等動物機體中重要化合物的組成成分[1]。一些奈瑟氏菌科和巴氏桿菌科細菌可從宿主轉鐵蛋白(transferrin,Tf)、乳鐵蛋白等鐵絡合物分子中獲取鐵離子[2]，具體過程是細菌外膜上的轉鐵結合蛋白B(transferrin binding protein B，TbpB)與Tf結合，脫去其輔基后使Tf與跨細菌外膜的轉鐵結合蛋白A(transferrin binding protein A，TbpA)結合[3]，通過TbpA將鐵離子轉運至細胞周質空間，鐵離子在細胞周質空間中被鐵結合蛋白A(ferric binding protein A，FbpA)識別并結合，FbpA將鐵離子遞呈給內膜FbpB-FbpC復合體，再將鐵離子轉運入胞漿[4]。由此可見，FbpA在細菌鐵代謝及毒力作用過程中發揮關鍵作用。

海藻糖比伯斯坦菌(Bibersteiniatrehalosi)為巴氏桿菌科比伯斯坦桿菌屬細菌，為人獸共患菌，可引起人面癰、腦膿腫、肺部感染及山羊發熱、呼吸急促、反復咳嗽、肺部出血性壞死等疾病，具有重要的公共衛生學意義[5]。相關研究表明，在巴氏桿菌科、奈瑟氏菌科等一些革蘭陰性菌中含有的FbpA能夠結合細菌周質空間中的Fe3+，是細菌獲鐵的重要途徑，為細菌毒力發揮中不可或缺的關鍵環節[6]。生物信息學分析顯示，海藻糖比伯斯坦菌含有FbpA，但其結構和功能尚不明確，需通過結構預測進一步分析。

本研究基于本課題組對山羊源海藻糖比伯斯坦菌TbpB的相關研究，對FbpA進行了原核表達和結構預測，為進一步探究FbpA在山羊源海藻糖比伯斯坦菌鐵吸收中的作用及山羊源海藻糖比伯斯坦菌的致病機理相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株來源2018年3月，本實驗室從重慶市榮昌區某羊場肺部感染死亡羊只體內分離純化得到1株細菌，編號為grc184，經生理生化試驗、16S rDNA、白細胞毒素蛋白、RNA聚合酶β亞基序列分析等方法鑒定其為海藻糖比伯斯坦桿菌[7]。將該菌株接種于含有10%無菌脫纖維兔血的瓊脂培養基，于37℃恒溫培養24 h，挑取單菌落接種5 mL BHI(brain heart infusion，腦心浸出液肉湯)培養基37℃、220 r/min恒溫振蕩培養24 h后用于DNA提取。

1.2 引物設計與PCR擴增取3 mL菌液，按照OMEGA公司的E.Z.N.A.?Bacterial DNA Kit說明書，提取該菌株基因組DNA。根據fbpA基因兩端的保守序列設計1對特異性引物：fbpA-F：5′-CCGCGGATCCATGAAAAAATCCC-3′；fbpA-R：5′-GCGCAAGCTTTTATTTTGCATCAAAC-3′。引物由重慶擎科興業生物技術有限公司合成。以該菌株基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得fbpA基因序列。反應體系：Premix TaqTMHot Start Version 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL(約100 ng)，ddH2O補至25 μL。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環；72℃延伸10 min，4℃保溫。

1.3fbpA基因的序列特征與進化分析將PCR擴增產物送至重慶擎科興業生物技術有限公司進行測序，并將測序結果由DNA序列轉換為氨基酸序列，與NCBI數據庫中流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、副豬嗜血桿菌(Haephilusparasuis)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)、淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae) 等的FbpA序列一起通過生物信息學軟件MEGA 7.0構建N-J系統發育樹。

1.4fbpA基因的克隆取1.2中的PCR擴增產物，經限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ酶切12 h，用PCR產物回收試劑盒回收純化酶切產物，與用同樣內切酶切割后回收的pET28a載體片段用T4DNA連接酶在16℃連接16 h。將連接產物轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞，取100 μL轉化后菌液，均勻涂布于含100 mg/L氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)的LB瓊脂培養基上，37℃恒溫培養16 h；挑取生長良好的單菌落接種于5 mL LB液體培養基(100 mg/L Amp)中，37℃、220 r/min恒溫振蕩培養12 h。取0.5 μL菌液，加入Premix TaqTMHot Start Version 12.5 μL及1.2中的上、下游引物各1 μL，用ddH2O補至25 μL，按照1.2的PCR反應條件進行PCR鑒定，選取陽性克隆菌株擴增培養并提取質粒進行序列測定，將序列正確的質粒命名為pET28a-fbpA。

1.5 FbpA的表達按照OMEGA公司E.Z.N.A.?Plasmid DNA Mini KitⅠ試劑盒操作說明提取重組質粒pET28a-fbpA，將其轉化進入大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，將含有重組質粒的大腸桿菌BL21(DE3)接種于自誘導表達培養基ZYM-5052(STUDIER FW,2005)中[8]，37℃、220 r/min恒溫振蕩培養過夜，表達目的蛋白。

1.6 滲透休克法提取FbpA取20 mL1.5中過夜培養的細菌充分混勻，4℃、4 000 r/min 離心20 min；收集細菌，加入10 mL含有40%蔗糖的30 mmol/L 的Tris-HCl(pH8.0)溶液，用吸管反復吹吸菌體，充分打散菌體，室溫搖晃10 min； 4℃、4 000 r/min 離心30 min；棄上清，將離心管倒置于紙巾上，徹底吸干多余溶液后，迅速加入1.5 mL 5 mmol/L 的MgSO4溶液，用吸管反復吹吸沉淀，打散菌體，然后置于冰上20 min；4℃、4 000 r/min 離心30 min，小心吸取上清至1.5 mL離心管，即為Osmotic Shock溶液[9]，通過SDS-PAGE檢測蛋白表達。

1.7 結構與功能預測將得到的山羊源海藻糖比伯斯坦桿菌fbpA基因的核苷酸序列轉換成蛋白質氨基酸序列，以已知的流感嗜血桿菌FbpA空間結構為模板，利用I-Tasser網站在線預測其空間結構，將預測的結構保存為pdb格式。根據得到的結構模型，通過PyMoL 2.3軟件將山羊源海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA結構與已經發表的流感嗜血桿菌、副豬嗜血桿菌、淋病奈瑟菌等菌的FbpA結構進行比對，分析預測海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA可能與鐵離子結合的氨基酸位點。

2 結果

2.1fbpA基因擴增結果取5 μL PCR擴增產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳、GoldviewⅡ核酸染料染色后，結果如圖1所示，在1 000 bp左右可見明亮條帶，大小符合預期。

M.DL2000 DNA Marker；1.fbpA基因擴增產物圖1 海藻糖比伯斯坦菌fbpA基因PCR擴增結果

2.2fbpA基因序列及其進化分析海藻糖比伯斯坦菌grc184株fbpA基因包含1 026個堿基對，編碼341個氨基酸，略長于流感嗜血桿菌(332個氨基酸)，但短于豬胸膜肺炎放線桿菌FbpA(585個氨基酸)。進化樹分析結果如圖2所示，海藻糖比伯斯坦菌grc184株FbpA與溶血性曼氏桿菌FbpA相似性最高，二者序列一致性約為83%，海藻糖比伯斯坦菌FbpA與溶血曼氏桿菌、副豬嗜血桿菌FbpA形成1個分支，區別于人流感嗜血桿菌、人淋病奈瑟菌、人腦膜炎奈瑟菌、百日咳波氏桿菌和豬胸膜肺炎放線桿菌FbpA。

圖2 海藻糖比伯斯坦菌FbpA N-J進化樹

2.3 FbpA蛋白表達純化后蛋白溶液經SDS-PAGE、考馬斯亮藍染色后，如圖3所示，在37 kDa左右可見明顯條帶，與FbpA預期大小相符。

M.蛋白預染Marker；1.FbpA蛋白圖3 FbpA SDS-PAGE結果

2.4 FbpA結構與功能預測通過I-Tasser網站在線預測海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA的空間結構，結果如圖4所示，與已經報道的其他細菌FbpA一樣，海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA有兩個結構域(N-lobe，C-lobe)組成，借助兩個反向平行β折疊將兩個結構域連接起來。根據已經報道的FbpA與鐵離子結合位點，結合序列分析，預測出在海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA中可能與鐵離子結合的位點：圖4中紅色顯示的164，221，222位酪氨酸，洋紅色顯示的32位精氨酸，33位谷氨酰胺，84位精氨酸與碳酸根離子一起與鐵離子結合。這6個氨基酸空間結構上靠近，都位于兩個結構域之間形成的裂縫中，連接兩個結構域的β折疊充當柔性鉸鏈，可通過旋轉調節兩個結構域的相對位置結合鐵離子或釋放鐵離子。

圖4 海藻糖比伯斯坦桿菌周質FbpA的空間結構預測

從海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA與鐵離子直接結合的氨基酸放大圖可見，FbpA通過這些氨基酸的氧原子與鐵離子結合(圖5)。紅色顯示的是酪氨酸，洋紅色顯示的是精氨酸，藍色顯示的是谷氨酰胺。

圖5 海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA與Fe3+結合氨基酸放大圖

3 討論

目前，蛋白原核表達的主要誘導方式為IPTG誘導，但IPTG誘導需要對誘導條件進行優化，且誘導產生的融合蛋白濃度較低[13]，因此，本研究采用了自誘導培養基誘導蛋白表達。相較于IPTG誘導培養基，自誘導培養基需要加入磷酸鹽、硫酸鹽、銨鹽、鎂離子、金屬離子、甘油、葡萄糖、乳糖等物質，其制備過程較為復雜，但其誘導后菌液的濃度和融合蛋白的表達量顯著高于IPTG誘導培養基[14]。

滲透休克法是利用高滲環境使細胞收縮，同時利用EDTA螯合吸附外膜脂多糖表面上的金屬陽離子,使細胞外膜受損,然后將收縮的細胞置入低滲環境中，由于滲透壓的變化，導致細胞外膜破裂，釋放周質蛋白。相較于傳統的超聲破碎法，本研究采用的滲透熱休克法能夠保證提取的細胞周質蛋白純度，避免胞內雜蛋白混入[15]。

通過對流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae)、溶血曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica)、和百日咳波氏桿菌(Bordetellapseudohinzii) FbpA-Fe3+結合位點的分析發現，結合Fe3+的氨基酸殘基幾乎全是酪氨酸和精氨酸，且均與碳酸根離子或碳酸氫根離子一起與鐵離子結合[16]。雖然海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA與哺乳動物Tf的一級結構只有20%的一致性，但它們的三維結構類似，都是由兩個結構域構成，結構域間通過反向平行β折疊連接，它們的功能都是結合鐵離子。流感嗜血桿菌FbpA的晶體結構和人Tf的晶體結構顯示，它們結合鐵離子的位點也是類似的[17]，這是由于協同進化的原因，所以細菌FbpA被稱為細菌的Tf，只不過細菌FbpA結合的是穿過外膜的鐵離子[18]。I-TASSER是由YANG等[19]開發的在線結構預測工具，本文通過I-TASSER在線預測了海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA三維結構，并根據已經發表的其他菌FbpA跟鐵離子結合的氨基酸位點，預測了海藻糖比伯斯坦桿菌FbpA可能與鐵離子結合的位點，分別是164,221,222位酪氨酸，32,84位精氨酸，33位谷氨酰胺，這些氨基酸在一級結構上雖然相差較遠，但在空間結構上均位于蛋白質兩個結構域的裂縫中，位置靠近，與鐵離子配體結合，在動力學上是合理的，這個預測結果為進一步研究其功能提供了參考氨基酸位點。此外，KHAN等[18]研究發現，鐵結合位點發生突變的FbpA結合Fe3+的能力有所下降，表明Fe3+結合位點氨基酸的變化對FbpA的功能有影響。

本研究運用計算機軟件對原核表達的海藻糖比伯斯坦菌FbpA進行了結構預測分析，下一步會對其進行質譜分析、晶體衍射等試驗，以驗證結構預測分析的結果。