檢測羊腸道病毒RT-PCR方法的建立及初步應用

董 坤，胡俊英，李卓宸，蔡夢露，章 凡，王瑋玉，王浴光，王新平 (吉林大學 動物醫學學院 教育部人獸共患病研究重點實驗室，吉林 長春 130062)

羊腸道病毒(caprine enterovirus,CEV)感染是近年來國內外報道的新發傳染病[1]，臨床上多以消化道和呼吸道癥狀為特征，發病羊群呈現腹瀉、呼吸困難，某些羊群呈現較高的發病率和死亡率。作為新發傳染病，CEV感染廣泛存在于國內不同地區的羊群，給養羊業造成了較為嚴重的經濟損失[2]。引起CEV感染的病原體為腸道病毒，屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬成員，是引起人類與動物臨床上以消化道、呼吸道、神經系統功能紊亂為特征的疫病的病原體之一[3-4]。根據國際病毒分類委員會(ICTV)的最新分類，腸道病毒屬共含有12個腸道病毒種(A～L)及3個鼻病毒種(A～C)，其中EV-E和EV-F主要感染牛，EV-G主要感染豬[5]。CEV作為新發現的病原體，目前被列為G種腸道病毒(EV-G)[6]。本實驗室在國際上首次分離出的CEV-JL14毒株被ICTV收錄為 EV-G20 的參考毒株[7]。由于CEV為新發疫病，有關其診斷與檢測方法研究較少，雖然目前檢測CEV的方法有病毒分離、電鏡觀察和夾心ELISA方法，這些方法均有其各自的優缺點以及適用性[8]，但不適用于臨床樣品的快速檢測。因此急需建立一種具有快速、簡便、特異性好、靈敏度高、易操作等特點的檢測手段，便于對臨床樣品進行快速檢測。本研究針對嚴重危害養羊業發展的新發CEV感染，建立了一種特異、敏感、快速、操作簡便且便于應用于臨床樣品檢測的RT-PCR檢測方法，為CEV感染的診斷提供有效的技術手段。

1 材料與方法

1.1 主要試劑TRIzol試劑、DNA Marker、Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶等購自TaKaRa生物技術有限公司；胎牛血清(FBS)購自HyClone公司；DMEM細胞培養液購自Sigma公司；青霉素(160×104U/瓶)、鏈霉素(100×104U/瓶)、瓊脂糖、核酸染料購自寶泰克生物科技(北京)有限公司；pGM-T載體購自安捷倫科技公司；DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 病毒毒株及細胞培養CEV-JL14毒株、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)CC13B 毒株由本實驗室分離并保存。按照常規方法，應用Vero細胞進行病毒培養。臨床糞便樣品采自吉林省發生腹瀉與呼吸道癥狀的疑似CEV感染羊群和臨床健康羊群。將臨床樣品用PBS按照1∶10進行稀釋，4℃、8 000 r/min離心20 min后取上清液通過0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，-80℃保存備用。

1.3 病毒RNA提取及cDNA合成應用Vero細胞進行病毒的培養。用病毒液接種細胞，當約70%的細胞出現病變時收取細胞，應用試劑盒提取RNA，置于-80℃保存備用。病毒cDNA的合成參照產品說明書進行，反應體系：3 μL隨機引物、3 μg RNA模板、1.5 μL M-MLV反轉錄酶、6 μL 5×RT Buffer、1.5 μL 10 mmol/L dNTP，用無RNase的ddH2O將反應體系補至30 μL。反應程序：30℃ 10 min，42℃ 59 min，70℃ 15 s，4℃ 1 min。制備的cDNA于-20℃保存。

1.4 引物設計與合成根據CEV-JL14毒株的基因組序列，設計合成1對CEV特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用于擴增CEV 5′UTR序列。引物序列：CEV-5′UTR-F：5′-CTTTGCACGCCTGTTTTCC-3′；CEV-5′UTR-R：5′-CACACGCTCGGAGGTTGGGAT-3′。預期擴增產物大小為497 bp。

1.5 RT-PCR擴增及反應體系優化以上述合成的cDNA為模板，應用特異性引物擴增目的序列，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。將PCR反應程序中的退火溫度設置在51～60℃，進行退火溫度的梯度試驗，確定PCR反應的最適退火溫度。

1.6 產物的克隆與測序將擴增的PCR產物，通過瓊脂糖凝膠電泳回收后，與pGM-T載體連接，轉化TOP10感受態細胞，挑取單個陽性菌落，提取質粒后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序結果與GenBank中的CEV序列進行比對，確認正確后，提取質粒，命名為pGM-T-5′UTR，使用超微量核酸蛋白分析儀測定其濃度并計算拷貝數。

1.7 特異性試驗應用RT-PCR方法檢測CEV、小反芻獸疫病毒(PPRV)、BVDV陽性樣品，同時以未感染CEV的陰性樣品和ddH2O為陰性對照，確定方法的特異性。

1.8 敏感性試驗將構建好的陽性質粒進行10倍倍比稀釋，以不同稀釋倍數的質粒為模板，以ddH2O為陰性對照，通過上述優化后的RT-PCR方法進行檢測，驗證該方法的敏感性。

1.9 重復性與應用性試驗應用RT-PCR方法重復檢測上述樣品3次，確定方法的重復性。將建立的RT-PCR方法與本實驗室已建立的雙抗體夾心ELISA方法進行比對，對28份臨床樣品進行檢測。

2 結果

2.1 RNA提取與鑒定提取接毒細胞的總RNA，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示，提取到的RNA質量較好，純度較高。

M.DL2000 DNA Marker；1.接毒細胞總RNA圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2 目的基因擴增將提取的接毒細胞總RNA反轉錄成cDNA，以其為模板，利用CEV 5′UTR特異性引物，通過PCR擴增目的序列片段，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行驗證，結果如圖2所示，擴增出497 bp的目的片段，與預期大小相符。

M.DL2000 DNA Marker；1.PCR擴增產物；2.陰性對照圖2 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 PCR反應條件的優化將PCR反應程序中的退火溫度設置在51～60℃，進行退火溫度梯度試驗，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測，確定PCR反應的最佳退火溫度，結果如圖3所示，在51～57℃時，目的條帶均較亮，本研究選取54℃進行后續試驗。

M.DL2000 DNA Marker；1～10.51～60℃；11.陰性對照圖3 確定最適退火溫度的梯度PCR擴增結果

2.4 特異性試驗應用RT-PCR方法檢測CEV、PPRV和BVDV陽性樣品，以未感染CEV的陰性樣品和ddH2O作為對照，擴增結果如圖4所示，僅有感染CEV的樣品檢測結果為陽性，其余樣品檢測結果均為陰性，說明該方法具有良好的特異性。

M.DL2000 DNA Marker;1.CEV陽性樣品；2～4.PPRV、BVDV、CEV陰性樣品;5.ddH2O圖4 RT-PCR方法特異性試驗

2.5 敏感性試驗所提取質粒的質量濃度為0.5 g/L，計算出pGM-T-5′UTR質粒的拷貝數為1.13×1011拷貝/μL，通過稀釋使其質粒拷貝數為1.13×108拷貝/μL，再按照10倍倍比稀釋，以稀釋產物為模板，通過RT-PCR方法進行檢測，確定方法的敏感性。結果如圖5所示，該方法對CEV的最低檢測限為1.13×103拷貝/μL，說明該方法具有較高的敏感性。

2.6 重復性與應用性試驗應用RT-PCR方法重復檢測上述樣品3次，結果一致，證明該方法具有良好的重復性。應用建立的RT-PCR和雙抗體夾心ELISA對28份臨床樣品進行檢測，檢測結果顯示，28份臨床樣品中含有6份陽性樣品和22份陰性樣品，G種腸道病毒檢出率為21.4%，兩種方法的符合率均為100%。

M.DL2000 DNA Marker;1～9.1.13×108～1.13×100 拷貝/μL pGM-T-5′UTR;10.陰性對照圖5 RT-PCR方法敏感性試驗

3 討論

CEV為近年來出現于國內外的新發傳染病，給養羊業造成嚴重的經濟損失[9]。本實驗室于2014年從發生嚴重腹瀉的山羊中分離出國際上首株CEV-JL14毒株，該病毒株目前被ICTV收錄為EV-G20的參考毒株[10-11]。CEV感染可引起以消化道、呼吸道和繁殖障礙為癥狀的疾病，如果與其他病原混合感染或發生其他病原的繼發感染，會導致羊群的病死率增加。流行病學研究發現CEV可與PPRV混合感染而使羊群病死率明顯增加，對養羊業的健康發展造成嚴重危害[12-13]。由于CEV感染是國內外近年來新發的疫病，有關該病的診斷與鑒別方法的研究匱乏，因此，建立腸道病毒檢測方法將會為該新發病毒感染的診斷及流行病學研究提供技術手段。目前有關CEV感染的檢測方法主要包括病毒分離鑒定和免疫學方法檢測等[14]。病毒分離成本高、耗時長、分離難度大；由于毒株之間存在明顯差異，用ELISA方法檢測病毒抗原，容易出現假陰性，同時溫度和時間等干擾因素對方法的重復性影響較大。RT-PCR是一種快速、準確、高效、可靠的檢測方法，具有靈敏度高、特異性強、重復性好等特點，也是當前用于疾病快速診斷和檢測的方法[15]。本研究根據G種腸道病毒毒株的保守區，設計引物并建立了檢測CEV的RT-PCR方法，在特異性試驗中僅擴增出CEV的目的條帶，而對BVDV、PPRV和BEV的cDNA，未擴增出任何條帶，表明此方法具有較高的特異性；同時通過敏感性試驗確定了該方法的最低檢測限為1.13×103拷貝/μL，表明該方法靈敏度較高。重復性與應用性試驗結果進一步證明此方法重復性良好，有利于該疾病診斷方法的標準化，具有易于大規模應用的潛力。應用新建立的和已有的ELISA方法進行比對，對6份陽性樣品和22份陰性樣品進行檢測，結果顯示，兩者的符合率為100%，表明該方法可替代現有的ELISA方法。本研究所建立的RT-PCR方法具有檢測時間較短、敏感性高、特異性強、重復性好的特點，可為羊群CEV感染的快速檢測及其流行病學調查提供有效的技術支撐。