外泌體介導(dǎo)小反芻獸疫病毒疫苗株N75-1在細(xì)胞間的傳播

張樂(lè)言，萬(wàn)陽(yáng)麗，王婉澤，許其華，馬楠謌，王晶鈺，齊雪峰* (.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 700；.山東省利津縣動(dòng)物疫病防治監(jiān)控中心，山東 利津 57400)

小反芻獸疫(peste des petits ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)所引起的一種跨境性傳染性疾病。該病毒侵染對(duì)象廣泛，除了山羊等小反芻獸，許多家養(yǎng)和野生的動(dòng)物都表現(xiàn)出對(duì)PPRV易感[1-3]。由于PPR具有高致死率的特性，加上長(zhǎng)期的地方流行，該病已經(jīng)成為阻遏發(fā)展中國(guó)家畜牧業(yè)發(fā)展的重大疫病之一[4-6]。因此，探究PRRV的傳播及致病機(jī)制，對(duì)PPR防控具有重大意義。PPRV是線(xiàn)性單股負(fù)鏈RNA病毒，其感染宿主后會(huì)抑制宿主的免疫反應(yīng)[7-12]。前期研究證實(shí)PPRV侵入機(jī)體后，首先侵染宿主的上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，受感染的淋巴細(xì)胞通過(guò)淋巴和血液循環(huán)在宿主體內(nèi)擴(kuò)散傳播，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)[13-20]。

外泌體是由細(xì)胞分泌的一種納米級(jí)囊泡，大小為30～130 nm，主要來(lái)源自細(xì)胞多囊泡體內(nèi)陷，包含多種功能性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA等，是細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的重要載體。近年研究表明，這些物質(zhì)均參與細(xì)胞間通訊和病原體轉(zhuǎn)移等過(guò)程[21-25]。自1983年外泌體首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，始終被認(rèn)為只是細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)的一種載體。直到2003年，GOLUDS等[26]根據(jù)研究結(jié)果提出了“特洛伊木馬-外泌體假說(shuō)”，認(rèn)為病毒能“挾持”外泌體包裹致病蛋白、基因組等病毒組分，并轉(zhuǎn)運(yùn)到全身各處，引起大規(guī)模地?cái)U(kuò)散感染，為研究病毒擴(kuò)散機(jī)制提供了新的方向。研究表明，病毒利用外泌體在細(xì)胞間擴(kuò)散可以逃避宿主自身的免疫作用，并導(dǎo)致免疫功能失調(diào)，造成病毒擴(kuò)散及產(chǎn)生免疫抑制[27-28]。通過(guò)對(duì)丙型肝炎病毒(HCV)、甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)等有囊膜病毒的研究，證明外泌體可以攜帶病毒的全部或部分基因組，在外泌體吸納細(xì)胞中建立增殖性感染，促進(jìn)病毒的傳播，而且，外泌體介導(dǎo)的病毒傳播可能是病毒逃避宿主免疫作用的一種途徑[29-30]。目前，有關(guān)PPRV致病機(jī)制的研究有很多，但是PPRV在細(xì)胞間傳播機(jī)制卻還不十分清楚。我們的前期研究表明，PPRV侵染細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞外泌體分泌水平升高[31]，提示PPRV侵染后可能會(huì)利用外泌體在宿主細(xì)胞間進(jìn)行傳播。

本研究旨在分析PPRV-exosome的特征并進(jìn)一步探究外泌體在介導(dǎo)PPRV細(xì)胞間傳播過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 病毒及細(xì)胞本研究所用毒株為PPRV疫苗弱毒株(N75-1)，由本實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增保存。所用細(xì)胞為Vero細(xì)胞(CCL-81)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)，并由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基為美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品；RIPA蛋白裂解液為碧云天生物公司產(chǎn)品；胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶為上海閃晶生物公司產(chǎn)品；熒光定量PCR試劑盒為北京全式金公司產(chǎn)品；CD81抗體、CD63抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記二抗為AbClon公司產(chǎn)品；Hoechst 33342、Triton X-100為北京索萊寶產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)為北京博奧拓達(dá)科技有限公司產(chǎn)品；GW4869為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 病毒感染分別用MOI=1，5，10的PPRV接種Vero細(xì)胞，間隔20 min搖晃，吸附1.5 h后棄掉培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(Mock組)，將培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 外泌體提取及純度檢測(cè)利用梯度超速離心法提取外泌體，具體操作：將細(xì)胞上清以300 r/min離心10 min，棄沉淀；2 000 r/min離心10 min，收集上清；10 000 r/min離心10 min除去細(xì)胞碎片，收集上清。將上清液用0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾，利用Exosome(外泌體)抽提試劑盒對(duì)外泌體進(jìn)行進(jìn)一步分離和純化，具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。利用透射電子顯微鏡及Western blot檢測(cè)外泌體純度。

1.5 Western blot分析在各組待測(cè)樣本中加入RIPA裂解液，4℃裂解20 min，提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，通過(guò)半干轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%的脫脂牛奶室溫封閉4 h，封閉結(jié)束后，TBST洗滌3次，加相應(yīng)的一抗溶液(CD63 1∶200，CD81 1∶200)，4℃過(guò)夜孵育，TBST洗滌5次，加二抗溶液(1∶5 000)，室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光試劑顯色，采集圖像。

1.6 激光共聚焦分析將 PPRV-exosome與正常的細(xì)胞進(jìn)行共孵育，對(duì)病毒N蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞中N蛋白表達(dá)情況，具體過(guò)程：將細(xì)胞(對(duì)照組和PPRV感染組)用4%的多聚甲醛室溫固定15 min，棄固定液，用PBS洗滌3次；加入0.5% Triton X-100，室溫處理10 min，PBS洗滌3次；加入5% BSA，室溫封閉2 h，PBS洗滌3次；加入一抗(抗N蛋白抗體 1∶1 000)，4℃過(guò)夜孵育，PBST洗滌4次；加入FITC標(biāo)記的二抗，室溫條件下，孵育1.5 h，PBST洗滌4次；用Hoechst 33342染細(xì)胞核5 min，PBST洗滌4次；利用激光共聚焦儀器成像，觀察N蛋白表達(dá)情況。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)外泌體中PPRV核酸水平通過(guò)RT-PCR檢測(cè)外泌體中是否包含PPRV基因組，具體步驟如下：用 TRIzol試劑分別提取外泌體RNA以及與外泌體共孵育的受體細(xì)胞總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以得到的cDNA為模板，根據(jù)PPRV基因組序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，TaqMix 2 μL，以ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物，使用凝膠成像儀成像并保存。

1.8 qRT-PCR法檢測(cè)PPRV核酸以1.7中獲得的cDNA作為模板，通過(guò)qRT-PCR分析細(xì)胞內(nèi)及培養(yǎng)上清中PPRV核酸水平。反應(yīng)體系：模板2 μL，上下游引物各0.4 μL，2×TransStare Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，以ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，58℃退火15 s，72℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.9 GW4869處理細(xì)胞抑制外泌體分泌通過(guò)細(xì)胞毒性檢測(cè)CCK-8法確定外泌體抑制劑GW4869的工作濃度。根據(jù)文獻(xiàn)[31-32]，用0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μmol/L GW4869處理Vero細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞毒性檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，確定接下來(lái)試驗(yàn)中GW4869的工作濃度為1.0，5.0，10.0 μmol/L。用上述濃度的GW4869預(yù)處理細(xì)胞，24 h后接種PPRV，并且設(shè)置對(duì)照，通過(guò)Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)N蛋白的表達(dá)水平；用不同濃度(1.0，5.0，10.0 μmol/L)GW4869預(yù)處理細(xì)胞24 h，接毒后，收集外泌體，將收集到的外泌體與受體細(xì)胞共孵育，利用Western blot和qRT-PCR，檢測(cè)受體細(xì)胞內(nèi)PPRV的復(fù)制情況。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的特征鑒定透射電子顯微鏡下觀察到外泌體呈典型的茶托樣結(jié)構(gòu)，直徑約為120 nm(圖1A)。在純化后的外泌體中沒(méi)有觀察到游離的病毒顆粒。Western blot結(jié)果表明，外泌體樣品中檢測(cè)到外泌體標(biāo)志蛋白CD63和CD81，且不能檢測(cè)到PPRV N和V蛋白(圖1B)，表明分離提取的外泌體純度高，且不含有病毒顆粒。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明， PPRV-exosome中可以擴(kuò)增出PPRV全基因組(圖1C)。

A.透射電子顯微鏡鑒定PPRV-exosome形態(tài)(標(biāo)尺=200 nm)；B.PPRV-exosome含有CD63和CD81，且不含有PPRV的N蛋白和V蛋白；C.PPRV-exosome中可以擴(kuò)增出PPRV全基因組圖1 PPRV-exosome的特征

2.2 PPRV-exosome與正常Vero細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞中PPRV增殖水平將 PPRV-exosome與細(xì)胞共孵育72 h，并設(shè)置陰性對(duì)照組(Mock-exosome)和陽(yáng)性對(duì)照組(PPRV-infection)。在顯微鏡下觀察到，陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，呈上皮細(xì)胞狀；與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)異常，出現(xiàn)合胞體型細(xì)胞病變(圖2A)。在激光共聚焦顯微鏡下，與Mock-exosome共培養(yǎng)組的細(xì)胞中沒(méi)有檢出病毒N蛋白(綠色熒光)，而在PPRV-exosome組和PPRV-infection 組中觀察到清晰明亮的綠色熒光(圖2B)。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，PPRV-exosome組和PPRV-infection組均檢測(cè)到PPRV-N蛋白條帶，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，PPRV-exosome組N蛋白的條帶微暗，但無(wú)明顯差異(圖3A)。TCID50檢測(cè)結(jié)果表明：陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞的病毒滴度較高，PPRV-exosome組細(xì)胞的病毒滴度略低，但卻沒(méi)有顯著性差異，而在陰性對(duì)照組細(xì)胞中未檢測(cè)到PPRV病毒顆粒(圖3B)。

A.Vero細(xì)胞與PPRV-exosome共孵育后細(xì)胞出現(xiàn)CPE(100×)；B.免疫熒光檢測(cè)Vero細(xì)胞與PPRV-exosome共孵育后細(xì)胞中PPRV-N蛋白(400×)圖2 正常Vero細(xì)胞與PPRV-exosome共孵育后細(xì)胞中PPRV鏡檢結(jié)果

A.Western blot法檢測(cè)Vero細(xì)胞與PPRV-exosome共孵育后細(xì)胞中PPRV-N蛋白；B.Vero細(xì)胞與PPRV-exosome共孵育后細(xì)胞的病毒滴度圖3 Vero細(xì)胞與PPRV-exosome共孵育后細(xì)胞中PPRV-N蛋白及PPRV增殖水平

2.3 外泌體抑制劑處理對(duì)PPRV外泌體傳播途徑的影響根據(jù)CCK-8毒性試驗(yàn)結(jié)果，確定GW4869的藥物濃度為1.0，5.0，10.0 μmol/L，用不同濃度的GW4869預(yù)處理細(xì)胞后24 h，提取外泌體，Western blot結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的不斷升高，外泌體的標(biāo)志蛋白CD63表達(dá)降低(圖4A)。用5.0，10.0 μmol/L的GW4869對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，培養(yǎng)24 h后接種PPRV，對(duì)照組細(xì)胞用DMSO處理24 h后接種PPRV，接種后48 h收集細(xì)胞和細(xì)胞上清，進(jìn)行Western blot和TCID50檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度GW4869處理的試驗(yàn)組細(xì)胞N蛋白的條帶亮度不顯著，表明N蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異(圖4B)；TCID50檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度GW4869處理的試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)病毒滴度幾乎相同，無(wú)明顯差異(圖4C)。利用qRT-PCR檢測(cè)上清液中病毒RNA的含量，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)GW4869預(yù)處理后，病毒RNA向細(xì)胞外的釋放水平受到明顯抑制(P<0.01)，隨著劑量增高，抑制水平也在不斷增加(圖5A)。提取不同濃度GW4869預(yù)處理后PPRV接種細(xì)胞分泌的外泌體，將外泌體與Vero細(xì)胞共孵育72 h，分別設(shè)置PPRV直接感染組和PPRV-exosome共孵育組兩個(gè)試驗(yàn)組，Mock-exosome共孵育組為陰性對(duì)照組。利用qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PPRV增殖情況。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，試驗(yàn)組N蛋白表達(dá)降低，結(jié)合qPCR結(jié)果可知，試驗(yàn)組Vero細(xì)胞中PPRV增殖水平均顯著降低(P<0.01)，且呈增殖水平與GW4869使用劑量成反比(圖5B，C)。

A.Western blot檢測(cè)GW4869對(duì)PPRV感染Vero細(xì)胞外泌體釋放水平的影響；B.Western blot檢測(cè)GW4869對(duì)PPRV感染Vero細(xì)胞中病毒復(fù)制的影響；C.GW4869對(duì)PPRV感染Vero細(xì)胞中病毒滴度的影響圖4 抑制外泌體釋放水平對(duì)PPRV感染Vero細(xì)胞中病毒增殖的影響

A.GW4869對(duì)PPRV感染Vero細(xì)胞培養(yǎng)上清中PPRV RNA的影響；B.GW4869對(duì)外泌體介導(dǎo)的PPRV在Vero細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的影響；C.GW4869對(duì)外泌體介導(dǎo)的PPRV在Vero細(xì)胞中病毒滴度的影響圖5 抑制外泌體釋放對(duì)外泌體介導(dǎo)PPRV傳播的影響

3 討論

PPRV是一種有囊膜的線(xiàn)性單股負(fù)鏈RNA病毒，與同屬的其他成員間存在結(jié)構(gòu)和遺傳上的相似性[32]。由于外泌體具有可以在靶細(xì)胞間自由移動(dòng)的特點(diǎn)，病毒利用外泌體進(jìn)行擴(kuò)散可以逃脫宿主的免疫作用，導(dǎo)致免疫功能失調(diào)[33-34]。本課題組前期研究表明，PPRV侵染會(huì)導(dǎo)致外泌體釋放水平增加，提示PPRV侵染后可能會(huì)利用外泌體在宿主細(xì)胞間傳播[31]。

分離提取得到高純度的外泌體，排除游離的PPRV對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾，是研究外泌體在病毒細(xì)胞間傳播擴(kuò)散機(jī)制中作用的保證。本研究采用梯度超速離心法提取外泌體，并利用外泌體提取試劑盒對(duì)外泌體進(jìn)行進(jìn)一步的富集純化，該方法的可靠性已經(jīng)在前期試驗(yàn)中得到驗(yàn)證[35]，所得外泌體純度高，且不含有病毒粒子，符合后續(xù)試驗(yàn)的要求。

一些囊膜包裹的RNA病毒在細(xì)胞間進(jìn)行擴(kuò)散時(shí)，可以利用外泌體包裹具有感染性的病毒基因組，促進(jìn)病毒的擴(kuò)散[29-30]。本研究結(jié)果證實(shí)，在PPRV-exosome中，能夠檢測(cè)到完整的PPRV全基因組。合胞體是包膜病毒感染細(xì)胞后，出現(xiàn)宿主細(xì)胞與同類(lèi)細(xì)胞融合的病變現(xiàn)象。在本研究中，將PPRV-exosome與細(xì)胞共孵育，顯微鏡下觀察到細(xì)胞有明顯的合胞體出現(xiàn)，與PPRV直接感染結(jié)果相同；進(jìn)一步利用激光共聚焦和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中PPRV-N蛋白的表達(dá)水平，兩種試驗(yàn)結(jié)果均顯示在吸納細(xì)胞中檢測(cè)到了PPRV-N蛋白的存在，表明PPRV可以利用外泌體包裹具有感染性的基因組，感染吸納細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。

本研究中所使用的GW4869是一種外泌體抑制劑，該抑制劑可以抑制神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生[36]。神經(jīng)酰胺在外泌體形成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，神經(jīng)酰胺的抑制會(huì)導(dǎo)致外泌體分泌水平下降。DOMENIS等[32,34,37]相繼證明了GW4869的使用會(huì)導(dǎo)致腸道病毒71、戊型肝炎病毒等病毒的釋放水平降低。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)GW4869預(yù)處理的細(xì)胞接種病毒后，細(xì)胞內(nèi)PPRV的復(fù)制并沒(méi)有受到明顯影響，但是PPRV的胞外釋放水平卻受到了顯著的抑制，尤其是PPRV在吸納細(xì)胞內(nèi)的增殖水平顯著降低，并且隨著劑量的不斷增高，抑制水平也在不斷的提高，進(jìn)一步證實(shí)外泌體是PPRV在細(xì)胞間傳遞擴(kuò)散的一條重要途徑。