PCV2/PCV3二價重組桿狀病毒疫苗的構(gòu)建與鑒定

徐 鵬，姜宇航，許 汪，宋利娜，李樂天，陳 競，郝鵬飛，金寧一，任林柱，李 昌* (1.吉林大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,吉林 長春 13006;.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 人獸共患病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新單元，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長春獸醫(yī)研究所，吉林 長春 1301)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)為單鏈環(huán)狀無囊膜DNA病毒，屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小動物病毒之一[1]。目前PCV分為PCV1、PCV2、PCV3和PCV4共4個基因型。PCV1是在PK-15細胞中被發(fā)現(xiàn)的，不具有致病性[2]。PCV2于1991年在患有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)和豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)的病豬中被發(fā)現(xiàn)，具有較強致病性與傳染性[3]。2016年，在美國發(fā)現(xiàn)的PCV3同樣可以引起PMWS、PDNS等豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(porcine circovirus associated diseases,PCVAD)，具有致病性。2019年，周繼勇團隊在湖南省患有呼吸道、消化道疾病和PDNS的豬群中首次發(fā)現(xiàn)一種新型豬圓環(huán)病毒——PCV4，其與PCV1～3型具有明顯的遺傳差異[5-6]。

PCV2全基因組的大小為1 767 bp或1 768 bp，具有11個開放閱讀框(ORF)[4]。其中ORF2負責(zé)編碼病毒的衣殼蛋白(Cap)，是病毒的主要抗原決定簇。PCV2是引起PCVAD的重要病原之一，患豬主要癥狀為消瘦、黃疸、貧血、皮膚蒼白[3]，還可以導(dǎo)致仔豬產(chǎn)生PMWS，引起大量死亡，死亡率最高可達30%[7]，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。PCV3基因組全長約為2 000 bp，含有3個開放閱讀框，其中ORF2編碼的衣殼蛋白(Cap)是主要的結(jié)構(gòu)蛋白與抗原決定簇[8]。PCV3感染的豬多會出現(xiàn)腹下黑斑、產(chǎn)死胎或木乃伊胎[9]，但種豬采食量和精神狀態(tài)良好，保育豬多發(fā)生混合感染，主要癥狀為精神狀態(tài)極差、高燒、扎堆、腹式呼吸等[9-10]，發(fā)病嚴重的豬場死亡率超過15%，給養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟損失[10]。

當前，PCV2與PCV3引起的PCVAD對世界各國的養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成威脅，由于這2種圓環(huán)病毒具有相似的病理特征與免疫抑制的特點，常常存在混合感染，嚴重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前，市場上存在針對PCV2的多種不同類型疫苗，例如滅活疫苗、亞單位疫苗、重組桿狀病毒滅活疫苗等，但是對于新發(fā)現(xiàn)的PCV3，由于該病毒的病原學(xué)研究尚不明確，國內(nèi)外尚未有PCV3疫苗臨床審批與上市的報道。

病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是一類由病毒的部分或全部結(jié)構(gòu)蛋白自動組裝成的，具有與天然病毒結(jié)構(gòu)基本一致的空心蛋白顆粒[11]，不具有病毒的遺傳物質(zhì)，不能自主復(fù)制，作用于機體后能夠引起機體產(chǎn)生類似于天然病毒感染的免疫應(yīng)答反應(yīng)[12]。因其具有免疫原性良好、安全性較高等特點，目前已成為研制預(yù)防人或動物病毒性感染疾病潛在的安全高效的候選疫苗之一[13]。為此，本研究以PCV2、PCV3為研究對象，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)構(gòu)建可同時表達PCV2 Cap與PCV3 Cap的VLPs疫苗，可用于同時預(yù)防PCV2、PCV3引起的疫病，具有重要現(xiàn)實和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料含有目的基因PCV2 Cap及PCV3 Cap的質(zhì)粒、DH10 Bac大腸桿菌感受態(tài)、Sf9細胞(貼壁與懸浮)由軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所分子病毒學(xué)與免疫學(xué)實驗室合成并保存；T4DNA Ligase，Color Prestained Protein Standard Broad Range購自NEB公司；DL5000 DNA Marker、Trans5α感受態(tài)細胞購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自BioFluX公司； TransStartFastPfu Fly Polymerase、pEASY-Blunt Simple購自北京全式金生物有限公司；胎牛血清(FBS)、青-鏈霉素溶液購自Gibco公司；Anti-6×His tag、HA tag抗體購自Abcam公司；pFastBacTMDual雙載體、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ限制性內(nèi)切酶購自Thermo Scientific公司；BSA、PBS、IPTG、X-gal購自索萊寶公司；DAPI、Western blot及IP用細胞裂解液、HRP-山羊抗鼠IgG、HRP-山羊抗兔IgG、FITC標記山羊抗鼠IgG、Cy3標記山羊抗兔IgG購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 引物設(shè)計與合成參考PCV2和PCV3的Cap基因設(shè)計引物，由吉林省庫美生物科技有限公司合成。擴增PCV2 Cap基因的引物上游添加了NotⅠ酶切位點和HA標簽，下游添加了HindⅢ酶切位點；擴增PCV3-Cap基因的引物上游添加了XhoⅠ酶切位點與His標簽，下游添加了KpnⅠ酶切位點。引物相關(guān)信息見表1。

表1 PCV2和PCV3的Cap基因擴增引物相關(guān)信息

1.3 Cap基因的擴增與重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建分別以含有PCV2 Cap、PCV3 Cap基因的質(zhì)粒為模板，用相應(yīng)引物擴增目的基因，PCV2-Cap擴增條件：95℃ 5min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min。PCV3-Cap擴增條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min。通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，回收目的片段，將之克隆至pEASY-Blunt載體，并轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)細胞，涂布于氨芐抗性的LB固體平板上，37℃倒置培養(yǎng)12 h。挑取單克隆菌株至氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒，分別用HindⅢ和NotⅠ、XhoⅠ和KpnⅠ進行雙酶切鑒定，對酶切正確的質(zhì)粒進行測序鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒分別命名為pEPC2、pEPC3。

將含有PCV2 Cap基因的質(zhì)粒pEPC2與pFBD-Dual載體分別用HindⅢ和NotⅠ進行雙酶切，回收目的基因片段和載體片段，通過T4DNA連接酶過夜連接，獲得含有PCV2 Cap基因的pFBD-Dual質(zhì)粒(pFBD-PCV2)。用XhoⅠ和KpnⅠ酶切pEPC3，回收目的基因片段PCV3 Cap，將其克隆至pFBD-PCV2，得到重組穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3。將重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Trans5ɑ感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，分別用HindⅢ和NotⅠ、XhoⅠ和KpnⅠ、HindⅢ和KpnⅠ進行雙酶切鑒定。

1.4 重組桿粒的制備將質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3轉(zhuǎn)化到DH10BacTM感受態(tài)細胞，涂布于含有四環(huán)素(10 mg/L)、硫酸卡納霉素(50 mg/L)、慶大霉素(7 mg/L)、IPTG/X-Gal的藍白斑篩選平板上，37℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取白色菌落加入SOC培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3 h，按照表1所示通用引物(pUC/M13-F，p10R；pHF，pUC/M13R)進行菌液PCR鑒定，選取鑒定正確的菌株擴增后提取桿粒，命名為Bacmid-PC2-PC3。

1.5 重組桿狀病毒的拯救接種Sf9貼壁細胞至6孔板中，27℃培養(yǎng)12 h后，更換原培養(yǎng)基為1 mL Grace's培養(yǎng)基。使用Grace's培養(yǎng)基稀釋陽性重組桿粒Bacmid-PC2-PC3(3 μg)和PEI(4 μL)，輕輕混勻，靜置20 min后加入6孔板。27℃靜置培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基為含有10% FBS、1%雙抗的SF-900Ⅱ培養(yǎng)基。于27℃靜置培養(yǎng)，每天觀察細胞狀態(tài)，待60%細胞出現(xiàn)病變(CPE)時，收取上清液為第1代重組桿狀病毒，用其繼續(xù)感染Sf9細胞，并傳至第3代，命名為rBV-PC2-PC3。

1.6 Western blot驗證PCV2、PCV3 Cap蛋白在Sf9細胞中的表達低速離心收集感染rBV-PC2-PC3的SF9細胞，使用細胞裂解液裂解細胞并進行超聲破碎，12 000 r/min離心3 min，收取上清液。SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)印至NC膜上，以1∶1 000稀釋的Anti-6× His tag及HA tag為一抗，1∶5 000稀釋的HRP山羊抗鼠IgG及山羊抗兔IgG為二抗，進行Western blot鑒定。

1.7 間接免疫熒光(IFA)鑒定PCV2、PCV3 Cap蛋白的表達取生長狀態(tài)良好的Sf9貼壁細胞均勻鋪入6孔板，待細胞增殖至培養(yǎng)面積的70%，每孔接種10 μL重組桿狀病毒rBV- PC2-PC3，27℃培養(yǎng)48 h后棄掉培養(yǎng)基，用4%甲醛固定液固定30 min，用0.1% Trion X-100透化處理10 min，5%脫脂乳封閉1 h；加入1∶1 000稀釋的Anti-6× His tag與HA tag抗體，孵育2 h；加入1∶1 000稀釋的FITC-標記的山羊抗鼠IgG與Cy3標記的山羊抗兔IgG，避光孵育1 h；加入1∶1 000稀釋的DAPI，避光孵育4 min，用熒光顯微鏡觀察。每步操作結(jié)束均使用PBST清洗3次。

1.8 電鏡觀察用rBV-PC2-PC3感染懸浮的Sf9細胞，27℃培養(yǎng)4 d即60%細胞出現(xiàn)明顯CPE時，收取細胞沉淀，超聲破碎后通過蔗糖密度梯度超速離心獲得濃縮樣品,1%磷鎢酸負染3 min后進行電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 Cap基因的擴增使用特異性引物進行PCV2與PCV3 Cap基因的擴增，擴增得到750 bp(PCV2 Cap)與 680 bp(PCV3 Cap)的目的條帶(圖1A)，與預(yù)期大小一致。分別回收目的片段并克隆至pEASY-Blunt載體，用限制性內(nèi)切酶NotⅠ和HindⅢ、KpnⅠ和XhoⅠ分別進行雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳后可見750 bp(PCV2 Cap)與680 bp(PCV3 Cap)左右的條帶，與預(yù)期大小一致(圖1B)。對酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行DNA序列測定，結(jié)果顯示，擴增所得的目的片段與原序列完全一致，表明成功獲得目的基因。

A.Cap基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(M.DL5000 DNA Marker;1.PCV2 Cap PCR產(chǎn)物；2.PCV3 Cap PCR產(chǎn)物)；B.重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果(M.DL5000 DNA Marker;1.重組質(zhì)粒HindⅢ和NotⅠ酶切產(chǎn)物；2.pEPC2 Cap重組質(zhì)粒；3.pEPC3 Cap重組質(zhì)粒；4.XhoⅠ和KpnⅠ酶切產(chǎn)物)圖1 Cap基因PCR擴增及重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.2 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建將含有PCV2 Cap與PCV3 Cap基因的質(zhì)粒及桿狀病毒穿梭表達載體pFBD-Dual分別用相應(yīng)的酶進行酶切，并依次連接到pFBD-Dual上，構(gòu)建含有PCV2 Cap基因與PCV3 Cap基因的穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3(圖2A)。酶切鑒定結(jié)果如圖2B所示，質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3能夠分別切出單個基因片段(PCV2 Cap/NotⅠ+HindⅢ、PCV3 Cap/XhoⅠ+KpnⅠ)及含有2個基因的片段(PCV2 Cap-PCV3 Cap/Hind Ⅲ+KpnⅠ)，表明重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A.穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3結(jié)構(gòu)示意圖；B.pFBD-PC2-PC3酶切鑒定(M.DL5000 DNA Marker;1.重組質(zhì)粒;2.XhoⅠ+KpnⅠ；3.NotⅠ+HindⅢ；4.HindⅢ+KpnⅠ)圖2 重組穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3結(jié)構(gòu)示意圖與酶切鑒定

2.3 重組桿粒的鑒定使用通用引物(pUC/M13-F+p10R；pHF+pUC/M13R)對菌液進行PCR鑒定，結(jié)果如圖3所示，引物 pUC/M13-R、pHF擴增得到1 500 bp左右的條帶，引物pUC/M13-F、p10R擴增得到2 400 bp左右條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組桿粒Bacmid-PC2-PC3構(gòu)建成功。

M.DL5000 DNA Marker;1～5.重組穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3的菌液PCR驗證(pHF+pUC/M13-R)；6～10.重組穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3的菌液PCR驗證(pUC/M13-F+p10R)圖3 重組穿梭質(zhì)粒pFBD-PC2-PC3的菌液PCR鑒定

2.4 重組桿狀病毒的拯救用重組桿粒Bacmid-PC2-PC3轉(zhuǎn)染Sf9貼壁細胞產(chǎn)生第1代桿狀病毒，轉(zhuǎn)染后48 h，與正常未轉(zhuǎn)染細胞(圖4A)相比，Sf9細胞開始出現(xiàn)細胞變圓、體積變大、細胞數(shù)目減少、細胞核明顯增大等現(xiàn)象(圖4B);轉(zhuǎn)染后120 h出現(xiàn)典型CPE現(xiàn)象，大部分細胞破裂，死亡(圖4C);表明重組桿狀病毒rBV-PC2-PC3拯救成功。

2.5 Western blot驗證PCV2、PCV3 Cap蛋白在Sf9細胞中的表達用rBV-PC2-PC3接種Sf9貼壁細胞，盲傳3代后，待細胞出現(xiàn)大約60%病變時收集細胞進行裂解，收取蛋白質(zhì)上清,經(jīng)SDS-PAGE后，用鼠源Anti-6×His-tag與兔源Anti-HA作為一抗進行Western blot分析。結(jié)果顯示，PCV2 Cap大小為28 kDa(圖5A)，PCV3 Cap大小為 24 kDa(圖5B)，與理論值相符，而對照細胞沒有條帶，進一步表明PCV2-PCV3 Cap在Sf9貼壁細胞成功表達并具有反應(yīng)原性。

A.正常的Sf9細胞；B.轉(zhuǎn)染后48 h；C.轉(zhuǎn)染后120 h圖4 重組桿狀病毒的拯救(200×)

A.PCV2 Cap蛋白表達鑒定 (M.蛋白Marker；1.Sf9細胞；2.Anti-6×His-tag抗體檢測重組蛋白)；B.PCV3 Cap蛋白表達鑒定(M.蛋白Marker；1.Sf9細胞；2.Anti-HA抗體檢測重組蛋白)圖5 重組蛋白的鑒定

2.6 PCV2、PCV3 Cap蛋白表達的IFA鑒定利用鼠源Anti-6×His-tag抗體與兔源Anti-HA-tag抗體，通過IFA檢測Cap蛋白的表達。結(jié)果顯示，正常Sf9細胞未出現(xiàn)特異性熒光(圖6A)，而感染重組病毒rBV-PC2-PC3的Sf9細胞出現(xiàn)特異性熒光，帶有His-tag標簽的PCV3表現(xiàn)為綠色熒光(圖6B、E、F)，帶有HA-tag標簽的PCV2表現(xiàn)為紅色熒光(圖6C、E、F)，在同一細胞中共同表達呈淺紫色熒光(圖6F)，表明外源Cap基因在桿狀病毒中成功表達。

圖6 IFA鑒定Cap蛋白的表達(200×)

2.7 VLPs的電鏡觀察透射電子顯微鏡下觀察經(jīng)蔗糖密度梯度離心的樣品，可見大量大小為20 nm左右的VLPs，呈現(xiàn)正二十面體結(jié)構(gòu),表面光滑、無凸起，符合PCV的基本形態(tài)特征(圖7)。

圖7 rBV-PC2-PC3 VLPs顆粒形態(tài)

3 討論

PCV1最早于1974年在PK15細胞中被發(fā)現(xiàn)[14]；PCV2是引起PMWS的主要病原之一，具有較強的致病性[15]。2016年，PALINSKI等[16]借助宏基因組測序技術(shù)從暴發(fā)PDNS疫情的美國某商品化豬場的患病豬中發(fā)現(xiàn)了一種新病毒，根據(jù)該病毒的基因組結(jié)構(gòu)和遺傳特性將其歸類為新型圓環(huán)病毒，并命名為PCV3。PCV4在患有呼吸系統(tǒng)疾病、腹瀉和PDNS的豬中被鑒定，表明PCV4可能對養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成潛在威脅[4]。

Cap蛋白作為PCV2、PCV3的重要結(jié)構(gòu)蛋白，同時也是病毒的抗原決定簇，是進行新型疫苗研究的首選蛋白。針對PCV2的商業(yè)化疫苗來說，國內(nèi)外大多研制的是亞單位疫苗，即采用桿狀病毒表達系統(tǒng)或原核表達系統(tǒng)表達的Cap蛋白與佐劑混合制成有免疫效力的疫苗[19-20]。此外，還有一小部分是PCV2全基因組滅活疫苗與嵌合病毒疫苗。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，目前出現(xiàn)了多種基因工程疫苗，比如利用其他表達系統(tǒng)的亞單位疫苗，如LIU等[21]利用腺病毒共表達PCV2 Cap蛋白與豬γ干擾素，免疫小鼠后可產(chǎn)生較強免疫效力；CHI等[22]利用重組偽狂犬病病毒表達PCV2 Cap的VLPs免疫小鼠和豚鼠后均能使其產(chǎn)生針對性的特異性抗體；以及具有很好免疫效果PCV1-2嵌合疫苗。此外，還有一些處于實驗室研究階段的核酸疫苗，如SYLLA等[23]構(gòu)建了Cap蛋白的重組質(zhì)粒pEGFP-Cap，并將其免疫BLAB/c小鼠，使其產(chǎn)生大量抗Cap蛋白特異性抗體，且IFN-γ和IL-10等細胞因子的表達水平也顯著升高；以及可用于區(qū)別自然感染和疫苗免疫的重組標記疫苗[24]。目前針對基于PCV3 Cap的疫苗只有通過桿狀病毒表達系統(tǒng)制備出來的亞單位疫苗，如王俊偉[25]對PCV3 Cap蛋白進行設(shè)計，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)成功表達出分泌型Sc蛋白與核定位Pc蛋白，且成功構(gòu)建了具有感染力的VLPs，用其免疫均可引起體液免疫與細胞免疫。

由于桿狀病毒對外源蛋白的良好承載能力以及可產(chǎn)生類似于天然病毒結(jié)構(gòu)的VLPs，所以本試驗使用桿狀病毒表達系統(tǒng)的雙表達核載體對PCV2、PCV3 Cap進行同時表達，做到使用一支疫苗可同時針對于2種病毒進行免疫，降低了疫苗的生產(chǎn)成本。

本研究分別將PCV2、PCV3 Cap插入雙表達桿狀病毒載體上，獲得穿梭質(zhì)粒，并通過藍白斑篩選獲得桿粒Bacmid-PC2-PC3，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將桿粒轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，成功獲得具有感染力的桿狀病毒rBV-PC2-PC3。將其感染Sf9細胞后，通過IFA和Western blot結(jié)果證明，利用昆蟲表達系統(tǒng)表達了具有良好抗原性的PCV2、PCV3 Cap蛋白，所表達的蛋白相對分子質(zhì)量約28 kDa與24 kDa，成功獲得重組桿狀病毒rBV-PC2-PC3的VLPs，可為后續(xù)研究提供借鑒。