一種可視化雙重熒光RT-LAMP方法鑒別不同毒力新城疫病毒

曾婷婷，謝麗基，謝芝勛，羅思思，李 孟，黃嬌玲，張民秀，張艷芳，范 晴，鄧顯文 (廣西壯族自治區獸醫研究所，廣西 南寧 530001)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由中等毒力或強毒力的新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的高傳染性、高致病性和高致死性的傳染病。NDV可以感染超過250種禽類和鳥類[1]，根據全基因組遺傳進化分析，NDV被劃分為ClassⅠ和ClassⅡ兩大分支[2]，目前引起發病的NDV絕大多數是ClassⅡNDV。世界動物衛生組織(OIE)根據NDV的3個致病指數，將NDV劃分為速發型、中發型和緩發型毒株[3]，即通俗稱的強毒、中等毒和弱毒。決定NDV毒力的主要基礎是F蛋白的前體F0蛋白能否被宿主蛋白酶裂解，所以F0蛋白裂解位點所對應的核苷酸序列可作為判斷NDV毒力的分子標志[3]。目前，已有研究者建立了針對這個位點的不同的分子生物學鑒別檢測方法，如RT-PCR[4]及qRT-PCR方法[5]等。環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是NOTOMI等[6]發明的等溫擴增技術，具有使用儀器簡單、檢測結果可視化、反應時間短等優勢，在各種疾病檢測中得到了廣泛的應用。本研究將分子信標引入LAMP反應體系，設計了一套能同時擴增ClassⅡNDV不同基因型F基因的LAMP引物，同時設計2條針對不同毒力NDV F0蛋白裂解位點對應核苷酸序列的分子信標，建立了一套能夠通過反應后觀測熒光信號判斷NDV毒力的雙重熒光RT-LAMP檢測方法。

1 材料與方法

1.1 病毒株本實驗使用病毒株均為本實驗室保存，具體見表1。

表1 毒株信息

1.2 主要試劑與儀器EasyPure?Viral DNA/RNA Kit，EasyPure?Quick Gel Extraction Kit，EasyScript?One-Step RT-PCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司；RT-LAMP試劑盒WarmStart?LAMP Kit (DNA & RNA) 購自美國New England Biolabs(NEB)公司；體外轉錄試劑盒RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems購自美國 Promega公司；超微量分光光度計NanoDrop 2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司；LA-320c LAMP實時濁度儀購自北京藍譜生物科技有限公司；多通道熒光成像儀ChemiDoc XRS+ Imager購自美國BIO-RAD公司。

1.3 引物設計使用MEGA X軟件比對不同毒力ClassⅡ NDV的 F基因，選取F基因1～600 bp片段，使用LAMP引物在線設計網站http://primerexplorer.jp/e/v4_manual/index.html進行通用引物設計。使用探針在線設計網站http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/設計探針，在探針左右兩端加上莖環序列，形成分子信標。中等、強毒NDV分子信標的5′端標記FAM熒光基團，3′端標記Dabcyl淬滅基團；弱毒NDV分子信標的5′端標記CY5熒光基團，3′端標記BHQ3淬滅基團。

1.4 核酸提取及質粒標準品構建按照核酸提取試劑盒說明書提取NDV毒株及其他毒株的RNA/DNA。使用引物(F:5′-ACTCAATCTATCTGTCGGGCTCA-3′，R:5′-GGCATTCTGGTTGGCTTGTAT-3′)對NDV毒株La Sota和F48E8進行RT-PCR擴增，回收片段后與pMD18-T載體連接，構建質粒后經過SpeⅠ酶切、線性化之后體外轉錄為ssRNA，測量濃度后計算拷貝數，并保存于-80℃ 備用。

1.5 RT-LAMP方法建立將LAMP引物稀釋并合并為引物混合物，各引物濃度：F3 5 μmol/L,B3 5 μmol/L,FIP 40 μmol/L,BIP 40 μmol/L,Floop 20 μmol/L,Bloop 20 μmol/L。RT-LAMP反應體系：2×RT-LAMP mix 12.5 μL，引物各1 μL，模板RNA 1～2 μL，用ddH2O補足25 μL。分別用濁度儀和水浴鍋同時進行反應。由于商品化RT-LAMP試劑盒已將各種反應底物優化至最優，因此本試驗僅進行反應溫度的優化。分別將NDV La Sota和F48E8體外轉錄的ssRNA片段濃度調整為106copies/μL作為模板，進行單重和雙重RT-LAMP反應。單重RT-LAMP反應的模板量為La Sota和F48E8 ssRNA各1 μL，分別加入不同反應管；雙重RT-LAMP反應的模板量為La Sota和F48E8 ssRNA各1 μL，加入同一反應管。溫度設置為60～70℃，每個反應升高1℃，反應時間為60 min，擴增結束后80℃、5 min終止反應，通過濁度儀觀測反應起始時間和反應產物的生成效率。

1.6 分子信標的濃度優化在最佳反應溫度下，在反應體系中添加分子信標，于0.001～1.000 μmol/L優化工作濃度，使用熒光成像儀觀測，使反應后陽性結果熒光強度足夠強，陰性結果熒光強度足夠弱。

1.7 特異性試驗和臨床樣品檢測分別使用表1中的各毒株進行RT-LAMP反應，驗證本方法的特異性。隨機選取本實驗室2017-2018年在廣西活禽市場進行NDV流行病學調查采集的拭子樣品，提取RNA通過RT-LAMP進行檢測，結果與前期的F基因測序結果互相驗證。

1.8 敏感性試驗和干擾試驗將La Sota和F48E8體外轉錄的ssRNA 10倍梯度稀釋為1×107～1×101copies/μL，分別進行單重和雙重RT-LAMP反應，單重RT-LAMP反應的模板量為La Sota或F48E8 ssRNA 1 μL，雙重RT-LAMP反應的模板量為同濃度的La Sota和F48E8 ssRNA各1 μL。將不同濃度的La Sota和F48E8 ssRNA混合進行雙重RT-LAMP反應，檢測不同濃度的模板對反應體系效果的影響。濃度組合分別為La Sota 1×106copies/μL，F48E8 1×102copies/μL；La Sota 1×102copies/μL，F48E8 1×106copies/μL；La Sota 1×107copies/μL，F48E8 1×103copies/μL；La Sota 1×103copies/μL，F48E8 1×107copies/μL。以上每個組合的每種模板各1 μL。

2 結果

2.1 引物設計使用LAMP引物在線設計網站和探針在線設計網站，獲得一套通用引物和分子信標。LAMP引物在單核苷酸多態性豐富的區域采用了簡并堿基，分子信標位于F0蛋白裂解位點對應的核苷酸位點，根據該位點的堿基組合方式，針對強毒、弱毒NDV各設計了2條分子信標，相關信息見表2。

表2 LAMP引物及分子信標信息

2.1 RT-LAMP反應溫度及分子信標濃度優化觀測不同溫度的反應起始時間，結果顯示，在65℃時，濁度儀檢測到單重和雙重RT-LAMP反應對模板的擴增起始時間最早，擴增效率最高。通過添加不同工作濃度的分子信標，反應結果如圖1顯示，分子信標的工作濃度為0.2 μmol/L時，可獲得最優的觀測結果。反應后使用熒光成像儀在FAM通道下，強毒為綠色，弱毒無色；在CY5通道下，弱毒為紅色，強毒無色。雙重RT-LAMP則2個通道都顯色，2個通道合并后為黃色，陰性對照則在2個通道下均為無色。

第1排.FAM通道；第2排.CY5通道；第3排.2個通道合并。1～8.陽性對照；9～16.陰性對照。分子信標濃度：1，9.0.8 μmol/L；2，10.0.6 μmol/L；3，11.0.4 μmol/L；4，12.0.2 μmol/L；5，13.0.1 μmol/L；6，14.0.05 μmol/L；7，15.0.025 μmol/L；8，16.0.01 μmol/L圖1 不同濃度分子信標的熒光成像圖

2.2 特異性試驗和臨床樣品檢測以表1中毒株的RNA/DNA為模板進行RT-LAMP反應，檢測反應的特異性，結果如圖2顯示，在濁度儀下，NDV毒株均有擴增，其他病原無擴增；在熒光成像儀下，NDV毒株C/Ulster/67、GX1806quail、GX1802pi-geon和La Sota均只顯示紅色熒光，其余NDV毒株只顯示綠色熒光，其他病原無熒光產生，證明本檢測方法可特異性鑒別檢測不同毒力NDV。隨機選取20份本實驗室2017-2018年在廣西活禽市場對各種活禽進行NDV流行病學調查時采集的拭子樣品[7-8]通過RT-LAMP檢測，結果顯示，RT-LAMP檢測結果與通過對樣品進行NDV分離鑒定和分離株F基因測序后推導的強弱毒株結果一致。混合感染不同基因型的樣品均能同時顯示出2種熒光(圖3)。

A.濁度儀觀測NDV毒株特異性試驗(1.NDV-/Ulster/67；2.NDV-GX1806 quail；3.NDV-GX1802 pigeon；4.NDV-La Sota；5.NDV-Mukteswar；6.NDV-GX1807 spotted dove；7.NDV-GX1808 spotted dove；8.NDV-GX1701 spotted dove)。B.濁度儀觀測NDV毒株特異性試驗(1.NDV-GX1810 turtle dove；2.NDV-GX1811 turtle dove；3.NDV-GX1812 pigeon；4.NDV-GX1/00；5.NDV-GX6/02；6.NDV-GX9/03；7.NDV-GX12/04；8.NDV-F48E8)。C.濁度儀觀測NDV毒株和其他常見禽類病原體特異性試驗(1.NDV-GX19/2011；2.NDV-159 Francolinus pintadeanus19；3.NDV-158 Francolinus pintadeanus18；4.IBV-H120；5.AIV- Duck/Guangxi/1/04；6.AIV-A/Duck/42846/07；7.AIV-A/Chinese Francolin/Guangxi/020B7/2010；8.ILTV-Beijing strain)。D.濁度儀觀測NDV毒株和其他常見禽類病原體特異性試驗(1.Mycoplasma gallisepticum-S6；2.FAdV4-GX001；3.Escherichia coli；4.Pasteurella multocida；5.Salmonella；6.陰性對照)。E.熒光成像儀觀測NDV毒株和其他常見禽類病原體特異性試驗(1.NDV-/Ulster/67；2.NDV-GX1806 quail；3.NDV-GX1802 pigeon；4.NDV-La Sota；5.NDV-Mukteswar；6.NDV-GX1807 spotted dove；7.NDV-GX1808 spotted dove；8.NDV-GX1701 spotted dove；9.NDV-GX1810 turtle dove；10.NDV-GX1811 turtle dove；11.NDV-GX1812 pigeon；12.NDV-GX1/00；13.NDV-GX6/02；14.NDV-GX9/03；15.NDV-GX12/04；16.NDV-F48E8；17.NDV-GX19/2011；18.NDV-159 Francolinus pintadeanus19；19.NDV-158 Francolinus pintadeanus18；20.IBV-H120；21.AIV- Duck/Guangxi/1/04；22.AIV- A/Duck/42846/07；23.AIV- A/Chinese Francolin/Guangxi/020B7/2010；24.ILTV- Beijing strain；25.Mycoplasma gallisepticum-S6；26.FAdV4-GX001；27.Escherichia coli；28.Pasteurella multocida；29.Salmonella；30.陰性對照)圖2 特異性試驗

1～23.拭子樣品；24.陰性對照圖3 雙重熒光RT-LAMP檢測活禽拭子樣品

2.3 敏感性試驗和干擾試驗La Sota和F48E8體外轉錄的ssRNA原始濃度分別為2.1×107copies/μL 和2.3×107copies/μL，將它們的濃度都調整為1×107copies/μL后，10倍梯度稀釋至1×107～1×101copies/μL。單重RT-LAMP結果如圖4顯示，對La Sota和F48E8 ssRNA模板的最低檢測量均為100 copies/μL，雙重RT-LAMP結果顯示，對2種模板同時檢測的最低檢測值也為100 copies/μL。根據反應起始時間可以發現，檢測到最低檢測濃度模板的時間于30 min內。干擾試驗結果顯示，對相差104倍的模板濃度，該方法仍能對不同的模板進行有效擴增，達到鑒別檢測的目的(圖5)。

A.濁度儀觀測F48E8敏感性試驗 (1.1×107 copies/μL；2. 1×106 copies/μL；3.1×105 copies/μL；4.1×104 copies/μL；5.1×103 copies/μL；6.1×102 copies/μL；7.1×101 copies/μL；8.陰性對照)；B.濁度儀觀測La Sota敏感性試驗 ( 1.1×107 copies/μL；2.1×106 copies/μL；3.1×105 copies/μL；4.1×104 copies/μL；5.1×103 copies/μL；6.1×102 copies/μL；7.1×101 copies/μL；8.陰性對照)；C.濁度儀觀測2種模板混合敏感性試驗 ( 1.1×107 copies/μL；2.1×106 copies/μL；3.1×105 copies/μL；4.1×104 copies/μL；5.1×103 copies/μL；6.1×102 copies/μL；7.1×101 copies/μL；8.陰性對照)；D.熒光成像儀觀測敏感性試驗 (第1排.F48E8；第2排.La Sota；第3排.2種模板混合；1.1×107 copies/μL；2.1×106 copies/μL；3.1×105 copies/μL；4.1×104 copies/μL；5.1×103 copies/μL；6.1×102 copies/μL；7.1×101 copies/μL；8.陰性對照)圖4 敏感性試驗

1.La Sota 1×106 copies/μL；2.F48E8 1×102 copies/μL；3.La Sota 1×106 copies/μL 和F48E8 1×102 copies/μL 混合；4.陰性對照；5.La Sota 1×102 copies/μL；6.F48E8 1×106 copies/μL；7.La Sota 1×102 copies/μL 和F48E8 1×106 copies/μL 混合；9.La Sota 1×107 copies/μL；10.F48E8 1×103 copies/μL；11.La Sota 1×107 copies/μL 和F48E8 1×103 copies/μL 混合；12.陰性對照；13.La Sota 1×103 copies/μL；14.F48E8 1×107 copies/μL；15.La Sota 1×103 copies/μL和F48E8 1×107 copies/μL混合；16.陰性對照圖5 干擾試驗

3 討論

LAMP技術發明以來，不斷發展改進，從一開始通過觀測反應產生的沉淀來判定結果，發展到加入SYBR Green Ⅰ或鈣黃綠素、TE等染料觀測結果[9-10]，雖然提高了可視性，但SYBR Green Ⅰ往往需要反應后開蓋加入，非常容易產生氣溶膠污染，且SYBR Green Ⅰ、鈣黃綠素、TE等都不能區分擴增產物、引物二聚體和非特異擴增。所以，范晴等[11]在前人研究基礎上，通過在FIP上標記熒光基團，反應后通過電泳觀測結果，從而消除引物二聚體或非特異擴增所產生的假陽性，且能達到1個反應體系同時鑒別檢測2種病原的目的。但這也需要開蓋并通過電泳完成，為了達到不開蓋觀察結果的目的，謝志勤等[12]在LAMP反應體系中引入TaqMan探針，LAMP反應過程中，TaqMan探針與擴增產物結合后再被水解，產生游離熒光基團，反應完成后可通過熒光成像儀觀測結果。分子信標是由TYAGI等[11]發明的一種熒光標記的分子探針，具有較高的靈敏度和極強的特異性，分子信標可與實時定量PCR相結合檢測目標基因，也可用于雙鏈DNA和蛋白質的檢測[14]。本研究使用分子信標與RT-LAMP技術相結合，反應前由于莖環結構，分子信標的熒光基團和淬滅基團靠近，熒光被淬滅，反應后，在80℃溫度下分子信標被打開，退火至室溫過程中，與目標片段結合，莖環結構打開，熒光基團和淬滅基團遠離，發出熒光，通過熒光成像儀的對應通道觀測熒光，且無需開蓋，防止了氣溶膠污染。

NDV的HN、M和P蛋白均可以影響NDV的毒力，但主要影響因素仍然是F0蛋白可否被宿主蛋白酶裂解為F1和F2蛋白，促進病毒囊膜和宿主細胞膜融合從而感染宿主細胞[15]。絕大多數的中等毒力、強毒力NDV的F蛋白裂解位點的氨基酸基序為112R/K-R-Q-K/R-R-F117，而弱毒力NDV的基序為112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117。近年來分離到的鴿源NDV，雖然使用雞作為致病指數測定的動物，顯示為中等毒力或弱毒，但對鴿子仍然表現為強毒[16]。因此，OIE仍然將F0蛋白裂解位點的核苷酸序列作為判斷NDV毒力的分子標志，在實際監測中也仍然符合絕大多數的NDV毒力特征。本研究基于這個分子標記設計分子信標，達到鑒別診斷不同毒力NDV的目的。

多年來不同實驗室對NDV的監測發現，不同基因型和不同毒力的NDV在同一個個體中共存是非常普遍的現象[8,17-18]，在之前的監測和診斷工作中，鑒別同一個個體是否感染不同毒力的NDV，需要經過RT-PCR擴增和測序等步驟，耗時長且人力、物力需求大，不利于大批量的流行病學調查和診斷。本方法可以快速鑒別不同毒力NDV，且在水浴鍋內可完成全部反應，直接通過熒光成像儀觀測結果，具有快速、高通量的特點，可以使大規模流行病學調查的效率大大提高。

綜上所述，本研究建立的區分不同毒力NDV的可視化雙重熒光RT-LAMP檢測方法，可以在30 min 內實現在同一個反應管內同時擴增不同毒力的NDV，最低檢測量達到100 copies/μL，并且在熒光成像儀下，可以通過不同的熒光色鑒別診斷不同毒力的NDV，為提高NDV的診斷和監測效率提供了新的技術手段，也為在不同試驗條件下檢測其他病原體提供了新的思路。