去泛素化酶抑制劑b-AP15抑制馬立克氏病病毒的復制

于 翀,王文婧，謝知航，周正軒，王 婷，范青松，王夢涵，呂 巖，許家翠，艾永興 (吉林大學 動物科學學院 人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062)

馬立克氏病(Marek's disease,MD)是致病型馬立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)引起雞的一種烈性傳染病，表現(xiàn)為免疫抑制、多臟器淋巴瘤和神經(jīng)麻痹等，常引發(fā)其他病原合并感染以及死亡。MD在世界各地廣泛存在，我國與埃及是MD的高發(fā)病率國家[1]。接種MD疫苗是控制MD暴發(fā)的最主要手段。近幾十年來，隨著疫苗的廣泛使用，MDV的毒力一直在不斷增強，出現(xiàn)了毒力更強的超強(very virulent，vv)和超超強(very virulent plus，vv+)型MDV株，這些毒株可造成感染雞發(fā)生嚴重的腦水腫和數(shù)日內(nèi)急性死亡[2-4]。通常每種新MD疫苗使用后約10年，就會出現(xiàn)毒力更強的毒株，而最有效的CVI988/Rispens疫苗早已超過了這個使用時限[2,5-6]，常有免疫雞群再次暴發(fā)MD的報道[4,7]，因此，MD對我國的養(yǎng)禽業(yè)仍是重要威脅。研究發(fā)現(xiàn)，MD疫苗只能暫時控制MD的暴發(fā)，但不能阻止MDV對MD疫苗免疫雞的感染以及在雞細胞內(nèi)的復制和釋放。MD疫苗免疫使雞壽命延長，為侵入雞細胞內(nèi)的MDV提供了充足的時間進行增殖、變異、成熟和傳播[3,5]。因此，經(jīng)MD疫苗免疫并被MDV強毒株感染而不發(fā)病的雞，就成為MDV新的傳染源。與此同時，疫苗免疫引起的免疫壓力還促進MDV毒力不斷增強[3]。因此，世界各國都在努力探尋各種辦法加強MD的防控，包括使用免疫佐劑調(diào)節(jié)劑、采用新接種方式、構建新型基因工程苗、培育抗性雞等方法[3,8-9]，同時還致力于闡明MDV致病分子機制的研究[10-15]，探尋可用于阻止MDV感染、增殖的靶點和通路，進而通過抑制MDV在細胞內(nèi)復制阻止MDV致病、切斷傳染源、彌補疫苗免疫的“短板”。MDV編碼的病毒型去泛素化酶UL36參與淋巴瘤的形成[16-17]，通過突變抑制其去泛素化酶活性可以抑制MDV在雞細胞內(nèi)的復制，也可降低MD的發(fā)生率，減少MDV的水平傳播[17]。而UL36的N端去泛素化酶(UL36 N端包含催化結構域和核定位信號的480個氨基酸片段，UL36-480)在所有致病型MDV株中完全保守[18]，這也說明其活性對MDV生命活動至關重要。本研究以去泛素化酶UL36-480為靶點，高通量篩選對UL36-480活性有抑制作用的化合物，并利用MDV細胞病變(cytopathic effect，CPE)模型以及MD動物模型進一步確定所篩選化合物對MDV復制的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞和毒株SPF級9日齡雞胚和1日齡雛雞購于北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司；CEF細胞根據(jù)常規(guī)方法制備[19]；MDV-J1株購于北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所，液氮保存。

1.2 主要試劑與儀器包括b-AP15(CAS 1009817-63-3)、GW7647(CAS 265129-71-3)、Rottlerin(CAS 82-08-6)、MLN9708(CAS 1201902-80-8)、6-Thioguanine(CAS 154-42-7)、Spautin-1(CAS 1262888-28-7)、Epoxomicin(CAS 134381-21-8)、MG132(CAS 133407-82-6)、USP7/USP47 inhibitor(CAS 1247825-37-1)、Pimozide(CAS 2062-78-4)、Aprotinin(CAS 9087-70-1)、Bestatin(CAS 58970-76-6)等在內(nèi)的2 448個蛋白酶抑制劑初選庫購于MCE(中國)皓元生物公司；Strep-Ub-PLA2底物、UL36-480去泛素化酶由本實驗室制備保存[18]；各種常用分析純化學試劑均購于鼎國公司；去泛素化酶切反應緩沖液10×Reaction Buffer(500 mmol/L HEPES，1 g/L BSA，5 mmol/L EDTA，10 mol/L DTT)及Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購于長春三邦化學公司；DMEM、ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix試劑盒、Gibco胎牛血清(FBS)購于一向科技公司；LA Taq DNA聚合酶購于TaKaRa公司； EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒購于全式金公司；雞淋巴細胞分離液由天津灝洋公司生產(chǎn)；FluoroMax 4熒光分光光度計購自HORIBA Scientific公司；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準26610購自ThermoFisher公司。

1.3 載體和引物用于定量分析的含有UL36 N端1 025個氨基酸片段編碼基因的標準質(zhì)粒pMD18-T-UL36-1025為前期研究構建[18]，其引物UL36 F：5′-AGTCCTGCGTCTTCAGTT-3′和UL-36 R：5′-CAGAAGTCGCTATTGTCC-3′由Genewiz公司合成。

1.4 UL36-480抑制劑的篩選以UL36-480酶水解Strep-Ub-PLA2底物反應體系為基礎[18,20]，以低于114 μmol/L的化合物能抑制UL36-480水解反應視為有效抑制作用[21]。反應體系：114 μmol/L化合物、 3 nmol/L UL36-480、1 μg Strep-Ub-PLA2、2 μL 10×Reaction Buffer，加滅菌H2O至20 μL。反應條件：先將含有不同化合物但無Strep-Ub-PLA2底物的反應體系在4℃孵育1 h，然后補充1 μg 的Strep-Ub-PLA2，于37℃孵育1 h；將酶切產(chǎn)物進行15% SDS-PAGE，分析結果。在0～114 μmol/L梯度稀釋篩選出的化合物，進一步確定完全抑制UL36-480活性的最低有效濃度。

1.5 b-AP15對UL36-480酶的抑制動力學分析反應體系包含不同濃度(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 μmol/L)的熒光底物Ub-AMC，1.4中確定的5 μmol/L b-AP15、3 nmol/L UL36-480、10 μL 10×Reaction Buffer，加滅菌H2O至100 μL。反應條件：先將不同濃度的b-AP15分別與UL36-480在4℃孵育1 h， 然后加入不含Ub-AMC的反應體系，37℃孵育2 min，再加入Ub-AMC后立即將熒光比色皿放于熒光分光度計進行熒光值檢測。應用GraphPad Prism 8.0軟件擬合酶動力學曲線，計算相關參數(shù)，分析b-AP15對UL36-480的抑制作用。對于非競爭性抑制按公式Ki=[I]/(Vmax/Vmaxinh-1)計算Ki值[22]，其中Vmaxinh為有抑制劑條件下的最大反應速度，Vmax為無抑制劑條件下的最大反應速度，[I]為抑制劑濃度，Ki為抑制常數(shù)。再應用Cheng-Prusoff方程計算IC50，對于非競爭性抑制使用公式IC50=Ki(1+Km/[S])計算IC50值[23-24]，其中Ki為抑制常數(shù)，[S]為底物濃度，Km為米氏常數(shù)，IC50為50%抑制濃度。

1.6 b-AP15對CEF細胞安全濃度確定96孔板每孔鋪入3×104個CEF細胞，用培養(yǎng)基將b-AP15稀釋成濃度梯度(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 μmol/L)，待細胞貼壁后更換含有梯度濃度b-AP15的培養(yǎng)基，終體積為100 μL，37℃培養(yǎng)3 d后，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，并根據(jù)CCK-8說明書檢測細胞活力，細胞活力>90%視為無顯著影響[25]，進而確定b-AP15對CEF細胞的安全濃度。利用Origin 2019作圖，橫坐標為藥物濃度，縱坐標為細胞活力，每個處理進行3次重復。

1.7 b-AP15對MDV CPE的影響六孔板中每孔鋪入8×105個CEF細胞， 貼壁長成單層后，將生長培養(yǎng)基分別更換為含有等體積DMSO或安全濃度b-AP15的培養(yǎng)基，并以120 PFU/孔接毒，3 d后在顯微鏡下觀察MDV的CPE變化，統(tǒng)計每孔CPE個數(shù)及面積。每個處理進行3次重復。

1.8 定量分析b-AP15對MDV在CEF細胞內(nèi)復制的影響首先將質(zhì)粒pMD18-T-UL36-1025的質(zhì)量濃度換算成拷貝數(shù)濃度，換算公式如下：拷貝數(shù)濃度(copy/μL)=質(zhì)粒質(zhì)量濃度(g/μL)÷質(zhì)粒相對分子質(zhì)量×NA(阿伏伽德羅常數(shù))，再以一定拷貝數(shù)梯度的標準質(zhì)粒為模板進行q-PCR，并繪制標準曲線，橫坐標為拷貝數(shù)(102，103，104，105，106，107共6個拷貝數(shù)梯度)的log值，縱坐標為Ct值，進行3次重復試驗，反應條件參考q-PCR試劑盒說明。應用EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒提取步驟1.7中每孔細胞的總基因組，提取方法參照試劑盒說明書進行，所有最終洗脫DNA體積均40 μL。以1 μL各處理組細胞基因組DNA為模板，應用引物UL36 F/UL36 R進行q-PCR，將每組得到的Ct值帶入標準曲線方程得到拷貝數(shù)，再乘以40即為每孔所含總MDV基因組的拷貝數(shù)。每組進行3次重復。

1.9 b-AP15對MDV在雞T淋巴細胞中復制的影響將1日齡SPF雛雞隨機分為3組，每組5只，分3個房間隔離飼養(yǎng)，均在1日齡時腹腔接種0.2 mL MDV-J1(約100 PFU)。參考文獻以及前期藥物安全劑量預試驗結果確定給藥劑量[26]，2個試驗組雞每日腹腔注射2 mg/kg和5 mg/kg的b-AP15，無藥物處理組雞每日腹腔注射等量滅菌生理鹽水(含等量藥物溶劑DMSO)，做為對照組。雞均在接種后21 d(感染后MDV增殖峰值期)采集外周抗凝血，按照雞T淋巴細胞分離液說明書分離T淋巴細胞[27]，每組取1×104個T淋巴細胞提取基因組，并應用引物UL36 F/UL36 R進行q-PCR分析。

2 結果

2.1 b-AP15抑制UL36-480的去泛素化酶活性如圖1所示，用Strep-Ub-PLA2作為底物對蛋白酶抑制劑初選庫進行篩選，結果發(fā)現(xiàn)，在114 μmol/L濃度條件下，b-AP15對UL36-480水解Strep-Ub-PLA2反應具有抑制作用，無水解產(chǎn)物產(chǎn)生，而其他化合物對UL36-480的酶活性均無抑制作用，UL36-480仍能水解Strep-Ub-PLA2產(chǎn)生PLA2和Strep-Ub兩種產(chǎn)物。進一步研究發(fā)現(xiàn)(圖2)，濃度高于10 μmol/L 的b-AP15均可完全抑制3 nmol/L UL36-480的酶活性，無水解產(chǎn)物產(chǎn)生。根據(jù)結果，選擇5 μmol/L的b-AP15用于3 nmol/L UL36-480抑制動力學分析。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1～12.分別為添加了化合物GW7647、ML-323、MLN9708、6-Thioguanine、Spautin-1、Epoxomicin、MG132、USP7/USP47 inhibitor、Pimozide、Aprotinin、Bestatin和b-AP15在UL36-480酶切反應體系；13.只含反應Buffer的空白組；14.無抑制劑的UL36-480酶切反應體系；15.Strep-Ub-PLA2蛋白圖1 部分化合物對UL36-480催化反應的影響

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1～6.分別添加50，20，10，5，2，1 μmol/L b-AP15的UL36-480酶切反應體系；7.Strep-Ub-PLA2蛋白圖2 不同濃度b-AP15對UL36-480催化反應的影響

2.2 b-AP15非競爭性抑制 UL36-480的酶活性檢測5 μmol/L b-AP15對3 nmol/L UL36-480水解不同濃度Ub-AMC的抑制作用，使用GraphPad Prism 8.0對所得數(shù)據(jù)進行分析，如圖3所示，無抑制劑條件下，UL36-480的Vmax為4.022 nmol·L-1·s-1，Km為0.691 μmol/L；添加5 μmol/L的b-AP15的條件下，UL36-480的Vmax為3.042 nmol·L-1·s-1，Km為0.691 μmol/L。據(jù)此判定b-AP15對UL36-480的抑制屬于非競爭性抑制，Ki值為15.52 μmol/L。底物濃度為0.8 μmol/L時b-AP15對3 nmol/L的 UL36-480的IC50為8.33 μmol/L。

A.米氏方程曲線；B.雙倒數(shù)擬合曲線。V.初始反應速度；[S].底物濃度；UL36-480.無抑制劑組；b-AP15.加b-AP15組圖3 b-AP15對UL36-480抑制動力學分析

2.3 b-AP15抑制MDV在CEF細胞中的復制為進一步分析b-AP15是否影響MDV在CEF細胞中的復制，先確定b-AP15在CEF上的安全劑量。如圖4所示，CCK-8法分析發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)基中含1 μmol/L b-AP15時，細胞活力未發(fā)生顯著變化(細胞活力>90%)，因此，后續(xù)細胞試驗使用低于1 μmol/L的b-AP15。應用0.25，0.50 μmol/L的b-AP15處理接種了MDV的CEF，鏡下可見CPE個數(shù)減少，面積減小(圖5)。對各孔總CPE進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)與無b-AP15的對照組相比，b-AP15顯著抑制CPE的產(chǎn)生，對照組的CPE平均為111個，而b-AP15處理組的CPE個數(shù)和每孔CPE平均面積都顯著低于對照組(P<0.01)(表1)。將含有UL36基因的標準質(zhì)粒進行拷貝數(shù)梯度稀釋，建立的標準曲線方程為y=43.131-1.702ln(x)，其中y為Ct值，x為拷貝數(shù)。提取各處理組細胞的基因組DNA，并進行定量PCR，根據(jù)標準曲線方程計算各處理孔中MDV的拷貝數(shù)，如表2所示，b-AP15處理組中所含MDV的拷貝數(shù)顯著低于對照組。與對照組相比，0.50 μmol/L b-AP15處理組MDV的拷貝數(shù)減少到1/407，0.25 μmol/L b-AP15處理組MDV的拷貝數(shù)減少到1/65。這些結果說明，b-AP15 有效抑制了MDV在CEF上的CPE，并抑制MDV在CEF細胞內(nèi)的復制。

表2 b-AP15對MDV在CEF中復制的影響

圖4 不同濃度b-AP15條件下CEF細胞活力分析

表1 b-AP15對MDV在CEF上的CPE的影響

圖6 MDV拷貝數(shù)標準曲線

2.4 b-AP15抑制MDV在雞T淋巴細胞內(nèi)的復制如表3所示，與對照組相比， b-AP15處理組T細胞中MDV基因組拷貝數(shù)顯著降低(P<0.01)，2 mg/kg b-AP15組降低到1/47，5 mg/kg b-AP15組降低到1/375。此結果表明，腹腔注射b-AP15可顯著抑制MDV在雞T細胞中的復制。

表3 b-AP15對MDV在雞T細胞中復制的影響

3 討論

泛素化修飾與去修飾過程是參與幾乎所有細胞進程的蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)節(jié)機制。宿主細胞編碼的以及一些病原體編碼的泛素化相關酶與去泛素化酶對這種機制的調(diào)節(jié)都影響著細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡，使其成為一些疾病的研究靶點[28]，如細胞內(nèi)的去泛素化酶USP1參與DNA損傷的修復，其抑制劑具有抗癌作用[29]。USP7不但是諸多病毒誘導宿主細胞轉(zhuǎn)化的重要靶點，同時也是維持基因組穩(wěn)定的重要調(diào)節(jié)酶[30]。病毒編碼的與泛素化調(diào)節(jié)相關的E1、E2、E3酶、去泛素化酶以及調(diào)節(jié)這些酶的蛋白可以調(diào)控細胞內(nèi)泛素化組的穩(wěn)態(tài)，進而抑制宿主細胞內(nèi)參與免疫調(diào)節(jié)的泛素化系統(tǒng)[27,31-32]。揭示這些病毒編碼的蛋白活性特點、闡明其對宿主細胞的調(diào)控機制，對于了解病毒致病機理以及研發(fā)靶向藥物具有重要的價值。許多動物病毒可以編碼類似的蛋白，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)HSV、KSHV、EBV、MDV、PRV、HCMV、SARS-CoV、MERS-CoV等病毒編碼USP類去泛素化酶[33-35]，EAV、PRRSV、CCHFV、DUGV等編碼OTU類去泛素化酶[36-37]。SARS-CoV、MERS-CoV編碼的去泛素化酶對這2種病毒的致病性至關重要，2種病毒的去泛素化酶的抑制劑可分別特異性抵抗這2種病毒，并且無交叉反應[38]。因此，以病毒編碼的去泛素化酶為靶點研發(fā)抗病毒藥物，是解決疫苗“短板”的一個重要策略。

本研究的前期工作已制備出有活性的MDV編碼的去泛素化酶UL36，確定了其水解底物的特異性以及酶動力學參數(shù)[18]，并揭示MDV可通過控制雞CD4+T細胞的泛素化組進而促進T淋巴細胞轉(zhuǎn)化成瘤[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過突變破壞UL36去泛素化酶活性可以抑制MDV在雞細胞內(nèi)的增殖，減少腫瘤發(fā)生并降低MDV的水平傳播能力[16-17]。據(jù)此，應用特異地靶向UL36的藥物抑制MDV在細胞內(nèi)復制，不但能增強MD疫苗的免疫效果，也可直接用于抵抗MDV。前期的研究發(fā)現(xiàn)，MDV編碼的UL36的催化活性區(qū)與其他病毒編碼的去泛素化酶甚至同一皰疹病毒屬所編碼的去泛素化酶在氨基酸序列、空間結構以及催化的底物特異性等方面均存在顯著性差異。本研究所建立的初選庫均為各種蛋白酶體或去泛素化酶抑制劑，經(jīng)過本研究的篩選也證實，只有個別抑制劑對MDV編碼的UL36具有抑制作用，也說明這些去泛素化酶在蛋白質(zhì)結構水平上存在差異，所以可產(chǎn)生抑制作用的化合物也不同。因此，本研究通過篩選以及酶動力學參數(shù)分析，確定所篩選化合物的靶向性，盡可能減少所篩選化合物在細胞水平的脫靶效應，也為未來臨床應用時盡可能減少毒副作用奠定基礎。

本研究所中篩選出的b-AP15對UL36的酶活性、MDV的CPE以及復制具有顯著的抑制作用。已有研究發(fā)現(xiàn)b-AP15是UCHL5 和 USP14等去泛素化酶的特異性抑制劑，可以誘導肺癌A549細胞、B淋巴瘤等腫瘤細胞的凋亡[39-41]，并抑制荷瘤小鼠腫瘤的增殖[40]。在病毒相關研究中，只發(fā)現(xiàn)b-AP15可通過抑制人T細胞的UCH37和USP14進而逆轉(zhuǎn)HIV的潛伏期，促進艾滋病的治療[42]，但b-AP15針對于其他病毒的研究還未見報道。動物細胞內(nèi)含有數(shù)百種去泛素化酶，b-AP15除了抑制MDV的UL36，是否還通過抑制細胞內(nèi)其他去泛素化酶或其他類型的酶進而抑制MDV復制，還需要進一步對其分子機制進行研究。在本研究中，使用了3 μmol/L 的b-AP15，此濃度高于b-AP15誘導人腫瘤細胞凋亡的濃度(1 μmol/L)[39-41]，但本研究未發(fā)現(xiàn)b-AP15誘導雞CEF凋亡，可能跟人與雞細胞內(nèi)泛素化調(diào)控凋亡的機制存在差異有關。MD雞模型水平的研究發(fā)現(xiàn)，使用報道5 mg/kg的每日用藥量可顯著抑制MDV在雞T細胞內(nèi)的復制。對照組在攻毒后20 d未出現(xiàn)明顯的腫瘤，只有個別雞有腸出血現(xiàn)象，但給藥組雞肝臟出現(xiàn)非MD的病變，這可能與b-AP15毒性有關。將每日用藥量降至2 mg/kg，給藥雞的肝臟仍有少量病變，而未用藥的對照組無此現(xiàn)象。因此，進一步開展b-AP15在雞體的藥代動力學與毒理學研究，可為b-AP15抗MD的臨床使用提供重要依據(jù)。

本研究確定了b-AP15可抑制MDV在雞細胞內(nèi)的復制，試驗中為防止雞紅細胞中基因組的干擾，也為確定等量T淋巴細胞內(nèi)MDV基因組的真實變化，消除MDV或b-AP15可能改變血液中T細胞含量對試驗的影響，本研究使用了等數(shù)量的所分離的雞外周血T細胞進行MDV基因組拷貝數(shù)變化的分析。另一重要原因是，雞T細胞是MDV最主要的復制場所，所以此方法所獲結果可直接體現(xiàn)MDV在雞體內(nèi)的變化，也為進一步研究b-AP15是否影響MDV通過T細胞浸潤毛囊細胞完成包裝、成熟以及釋放活動提供直接參考。

由于MD疫苗不能抑制MDV在雞細胞內(nèi)的復制、成熟和釋放，因此，b-AP15抑制MDV在雞細胞內(nèi)的復制可彌補疫苗免疫的不足，b-AP15可作為疫苗的增強劑用于臨床研究。同時，本研究結果為b-AP15的分子改造以減少毒副作用以及推動抗MD靶向新藥的研發(fā)提供了依據(jù)。還有很多病毒編碼的去泛素化酶的功能尚未闡明，本研究也可為其他動物病毒病的靶向藥物研究提供參考。