區域性耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌耐藥基因型的分析*

佟忠山，尤玉紅，姜月紅，杜 英，杜 巍，孫 磊

黑龍江省醫院檢驗科，黑龍江 哈爾濱 150001

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）是臨床感染性疾病常見的病原菌，可引起社區獲得性感染和醫院感染，約占臨床革蘭陰性細菌感染的30%，可引起呼吸道、血液、腹腔和泌尿系統等部位感染，特別是免疫力低下的人群更易感染［1］。碳青霉烯類抗菌藥物是抗菌譜最廣，抗菌活性最強的非典型β-內酰胺類抗生素，已成為治療嚴重細菌感染的最主要抗菌藥物之一，隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床的廣泛應用，全國耐藥監測網統計顯示耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌（carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，CR-KPN）檢出率持續上升，從2013年的4.9%上升至2019年的10.9%［2］，為臨床抗感染的治療增加很多困難和經濟成本，區域CR-KPN耐藥性及耐藥基因的研究，為本地區CR-KPN院感防控及臨床相關感染治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

黑龍江省醫院是哈爾濱地區三甲醫院，收集醫院2018年1月—2020年12月臨床分離的KPN 3 371株，去除同一患者同一部位相同菌株，以首次分離菌為準。篩選亞胺培南、美羅培南和厄他培南任一非敏感菌株為CR-KPN的36株納入本研究。

1.2 儀器與試劑

BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定、藥敏系統及其配套試劑（美國碧迪公司）。美羅培南藥敏紙片（英國Oxoid公司），替加環素藥敏紙片（美國輝瑞公司），血平板、麥康凱平板和MHA平板（鄭州博賽公司）。碳青霉烯酶檢測試劑盒購于長沙中生眾捷生物技術有限公司。

1.3 標準質控菌株

大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603，購自國家衛生健康委臨床檢驗中心。

1.4 菌株鑒定及藥敏試驗

菌株分純配制0.5麥氏濁度菌懸液，經BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統進行細菌鑒定及藥敏試驗，并用Kirby-Bauer法補充替加環素和頭孢哌酮/舒巴坦藥敏試驗，結果按美國臨床微生物實驗室CLSI M100第30版標準判讀。

1.5 碳青霉烯酶表型篩查

篩查參考美國臨床微生物實驗室CLSI M100第30版改良碳青霉烯滅活試驗方法，取血平板上過夜孵育的1 ul滿環KPN接種至2 ml TSB中，漩渦震蕩10～15 s，用無菌鑷子將一張10μg美羅培南紙片加入每一菌液管中，確保紙片完全浸沒于菌懸液中。在35±2℃空氣環境孵育4 h±15 min，完成TSB-美羅培南紙片菌懸液孵育后，立即用生理鹽水或營養肉湯制備大腸埃希菌ATCC25922 0.5麥氏濁度標準菌懸液，按紙片擴散法常規步驟將大腸埃希菌ATCC25922涂布于MHA培養基上，平板干燥3～10 min后，使用10μl接種環從TSB-美羅培南紙片菌懸液中取出，貼在事先涂有大腸埃希菌ATCC25922的MHA瓊脂表面。在空氣環境35±2℃孵育18～24 h后，測量抑菌圈直徑6～15 mm之間或16～18 mm抑菌圈內存在針尖樣菌落為碳青霉烯酶陽性。

1.6 耐藥基因檢測

取提取緩沖液5滴加入EP管中，使用1 ul接種環取一環碳青霉烯酶表型篩查陽性待測菌株置于含有提取緩沖液的EP管中，合上EP管，使用渦旋儀震蕩混勻后放置室溫10 min，然后用吸管吸取5滴制備好的混合液，加入膠體金免疫層析檢測卡中，室溫放置15 min讀取結果。C線區出現一條紅線并且在K、O、V、I、N檢測線區出現一條或多條紅線判讀為陽性結果，同時對blaKPC、blaOXA-48、blaVIM、blaIMP和blaNDM五種常見碳青霉烯酶基因型進行檢測［3］。

2 結果

2.1 CR-KPN臨床分布情況

2018年1月—2020年12月醫院分離出3 371株KPN，其中36株CR-KPN（1.07%），主要分離自神經外科（25%），ICU、康復科、呼吸科和心血管內科（各13.9%）；CR-KPN感染患者年齡主要集中在80歲以上老年群體（36.1%），并且以男性患者為主（83.3%），多分離自呼吸道標本（66.1%），見表1。

表1 36株CR-KPN的臨床分布情況

2.2 藥敏結果

36株CR-KPN對臨床常見抗菌藥物藥敏結果如表2所示，對氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢唑啉、亞胺培南的耐藥率為100%，對氨曲南、頭孢吡肟、阿莫西林/克拉維酸、環丙沙星、四環素、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、美羅培南的耐藥率接近100%，但阿米卡星（5.56%）、替加環素（35.49%）和慶大霉素（44.44%）的耐藥率低于45%，氯霉素和左氧氟沙星也有20%以上的敏感度，見表2。

表2 36株CR-KPN對臨床常見抗菌藥物耐藥性統計表

2.3 碳青霉烯酶表型試驗及基因檢測結果

36株CR-KPN改良碳青霉烯滅活試驗陽性率100%，耐藥基因檢出情況如表3所示。醫院分離的CR-KPN主要攜帶blaKPC基因型，檢出blaKPC35株（97.22%），檢出blaNDM，聯產blaKPC+blaVIM和blaKPC++blaIMP各1株（2.78%），未檢出blaOXA-48，見表3。

表3 36株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）耐藥基因檢出情況

3 討論

全國CR-KPN檢出率從2014年的6.4%上升至2019年10.9%。通過醫院研究結果表明本地區明顯低于全國CR-KPN檢出率，但近兩年呈逐年上升趨勢，需引起臨床高度重視。CR-KPN主要來源于神經外科、ICU和康復、呼吸等科，患者合并兩種以上慢性病，住院時間超過三周，留置插管兩種以上，應用碳青霉烯類藥物一周以上易檢出CR-KPN感染［4］，存在上述危險因素患者需加強病原菌監測，盡早檢出并及時治療。

本研究結果顯示，醫院檢出的CR-KPN對一二三四代頭孢菌素及克拉維酸和舒巴坦等常用酶抑制劑β-內酰胺類抗生素都耐藥，對阿米卡星和慶大霉素氨基糖苷類、四環素類等抗生素有一定敏感度，可能與氨基糖苷類抗生素主要通過與細菌核糖體結合，干擾細菌蛋白質的合成，發揮殺菌作用，與碳青霉烯類抗生素作用機制不同有關，上述情況與李珂等的研究結果一致［5］。CR-KPN耐藥廣，而且氨基糖苷類和四環素類抗生素副作用大，限制了臨床使用，新藥頭孢他啶/阿維巴坦對blaKPC基因型CR-KPN有很好抑制作用，對blaNDM基因型CR-KPN無作用，而攜帶blaNDM金屬酶的CR-KPN對氨曲南水解作用弱，氨曲南對其有一定抑制作用，所以可以參考耐藥基因型合理選擇抗菌藥物治療。

綜上所述，哈爾濱地區CR-KPN臨床檢出逐年增加，其耐藥性強，難清除，臨床抗感染難道大，需加強病原菌監測，并進行耐藥基因檢測，CR-KPN耐藥機制復雜，需進一步研究更好指導臨床合理使用抗菌藥物，做好院感防控避免院內感染的爆發流行。