2020年血清中總膽紅素測定比對試驗結果分析

于 婷，張娟麗，孫 晶，曲守方△，黃 杰

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.河南省醫療器械檢驗所，河南鄭州 450003

血清總膽紅素(TBIL)是人體衰老紅細胞遭到破壞后產生血紅蛋白進而衍化生成，是診斷新生兒高膽紅素血癥[1-3]及肝膽疾病等的重要指標[4-6]。測定方法包括參考方法(Doumas法)[7]及常規方法如重氮法、化學氧化法/釩酸鹽氧化法和氧化酶法[8-10]等。YY/T 1205-2013 總膽紅素測定試劑盒(釩酸鹽氧化法)[11]行業標準也已發布多年。基于注冊檢驗、監督抽驗等任務基礎，國內大部分醫療器械檢驗機構開展了總膽紅素檢測項目。為考察檢測機構總膽紅素的檢測能力，保證結果的準確性和公正性，同時促進實驗室間的技術交流，2020年中國食品藥品檢定研究院(下稱本院)在全國范圍內組織開展TBIL測定比對試驗。

1 材料與方法

1.1材料 本次試驗于2020年11-12月發放3份比對試驗用樣本，其中1份為比對樣本，2份為干擾樣本。收集外觀透明、澄清，無明顯黃疸、溶血和脂血的血清，且傳染病4項(乙肝病毒表面抗原、丙肝病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體和梅毒螺旋體抗體)均為陰性。對收集到符合要求的血清樣本依次進行普通濾紙初濾、0.45 μm、0.22 μm濾膜過濾。過濾好的血清按照0.5 mL分裝，-70 ℃或以下條件下保存。

1.2方法

1.2.2比對樣本的均勻性和穩定性分析 采用參考方法按照CNAS-GL003:2018《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》[12]進行均勻性、穩定性評價。在樣本分裝的前期、中期和末期分別抽取15支、20支和15支，采用全自動生化分析儀對抽取樣本進行測定，每份樣本測定3次。利用單因素方差法進行分析，當F值小于自由度為(f1,f2)及顯著性水平(α=0.05)所對應的臨界值Fα(f1,f2)，表明樣本之間差異無統計學意義。

在第1、2、3、5、7、12、20、30天這8個時間點上均隨機取出6支樣本，分別置于20～25 ℃、2～8 ℃、-20 ℃條件下各2支。在第31天將所有樣本取出統一測定。所有取樣時間保持一致。采用全自動生化分析儀對樣本進行測定。每個樣本測定3次，取均值。以時間為橫坐標，測定值為縱坐標作圖，進行線性擬合回歸分析，評價樣本測定值的趨勢性變化，并計算斜率k、截距b和斜率k的標準差sk。在自由度為n-2，置信水平P=0.95(95%的顯著水平)條件下，查t-分布臨界值表，得到對應的t(0.95,n-2)值，計算t(0.95,n-2)·sk的值，比較|k|與t(0.95,n-2)·sk的值，如果|k|

1.3比對試驗要求 本次比對試驗，要求已有TBIL檢測能力認可資質的醫療器械檢測機構必須參加，其他實驗室自愿報名參加。參加實驗室應合理選擇具有注冊證的TBIL測定試劑盒及檢測儀器，按照作業指導書進行檢測并報告結果，要求每份樣本應重復測定不少于5次，計算測定均值(保留2位小數)及變異系數(保留1位小數)。作業指導書中要求：實驗前取出的樣本應避光恢復至室溫20～25 ℃，充分混合后檢測，且務必在4 h內使用，整個操作過程中亦應注意避光。

1.4試驗結果判定原則 根據定值結果及參考YY/T 1205-2013 TBIL測定試劑盒(釩酸鹽氧化法)中“3.7.1批內精密度”項“批內精密度應不大于5.0%”的要求，確定2條判定的基本原則：(1)比對樣本測定值應在(27.10±2.71)μmol/L范圍內；(2)3份樣本檢測結果的批內精密度應不大于5.0%。參加實驗室的檢測結果必須同時滿足：比對樣本應滿足(1)和(2)判定原則，且干擾樣本滿足判定原則(2)，方可判定為滿意，否則即判定為不滿意。

2 結 果

2.1比對樣本均勻性、穩定性及定值結果 采用單因素方差分析方法對數據進行分析，比對樣本F值為1.234 1，小于F0.05(1.355 2)，說明均勻性良好。結果見表1。

表1 比對樣本均勻性檢驗結果

對比對樣本進行3種溫度條件下的30 d短期穩定性評價，由表2結果可知，樣本在3種溫度條件下放置30 d均不穩定，減少時間點數重新進行統計學分析，結果表明，在20～25 ℃條件下，只在當天穩定；在2～8 ℃條件下，可穩定2 d；-20 ℃條件下，可以穩定5 d。同時對室溫20～25 ℃ 24 h內的避光穩定性進行了研究，結果顯示20～25 ℃ 4 h內穩定。見表2、3。

表2 比對樣本穩定性檢測結果(μmol/L)

3家實驗室聯合定值，得到4組獨立數據，分別為(26.93、27.14、27.33、26.99 μmol/L)，比對樣本定值結果的實驗室內變異系數不高于0.6%，表明各實驗室建立的參考方法重復性好，數據可靠。最終以聯合定值的均值，作為比對樣本靶值，結果為27.10 μmol/L。

2.2比對試驗結果 本次共有40家實驗室報名參加本次比對試驗，來自全國23個省(自治區)、直轄市，包括各地醫療器械檢驗所/食品藥品檢驗機構和大學/企業實驗室。其中檢驗機構30家，大學/企業實驗室10家。最終，共有39家按要求提交了結果報告。根據評價原則，34家實驗室的比對樣本血清TBIL測定值滿足要求，35家實驗室3份樣本測定結果的CV滿足要求，最終獲得結果滿意的實驗室為31家，滿意率為77.25%，結果不滿意的實驗室為9家(含未上報數據的實驗室)，不滿意率為22.75%。見表4。

表3 比對樣本穩定性分析結果

表4 2020年血清中TBIL測定比對試驗數據匯總表

3 討 論

本次比對試驗選擇的是TBIL項目，由于膽紅素并不穩定，容易見光分解，因此本院對其穩定性進行了較為充分的研究。除了通過30 d的短期穩定性了解其在3種不同溫度下的穩定時間外，還開展了長期穩定性(-70 ℃或以下)的定期監測，以及在分發樣本前，再次進行了-20 ℃ 5 d的監測，結果均滿意。在樣本正式發放時，選擇專業冷鏈公司采用干冰運輸，并對整個運輸過程中的溫度進行監控，以及確保5 d內到達參加實驗室，實際2～3 d即可到達。本院在作業指導書中亦明確告知參加實驗室，收到樣本確認完好且溫度至少在-20 ℃以下后，應盡快置于-70 ℃或以下保存，開封后應注意避光，并在4 h內完成檢測。以上措施均保證了本次比對試驗不會因樣本的問題影響各參加實驗室的結果，達到真正評價的是參加實驗室的檢測能力。

對于本次產生不滿意的結果，分析主要可能有以下方面：(1)不嚴格按照說明書要求進行試驗。有兩類情況比較突出，一是說明書要求使用配套的校準品或者推薦采用某廠家校準品，實際采用了其他廠家的校準品；二是說明書中給出了試劑及樣本的加樣量，部分說明書提到試劑和樣本用量可根據不同儀器要求按比例改變。然而，部分參加實驗室未按照要求加樣，或者不按比例減少加樣量。比如“樣本/R1/R2”的加樣量，要求8 μL/240 μL/60 μL，實際為8 μL/200 μL/50 μL，雖試劑加樣量是等比例減少，但樣本量并未等比例減少。實驗室必須清楚意識到，說明書是廠家通過多次研究確定的操作程序，應嚴格按照要求進行操作，不應隨意調整，如要改變，必須作性能確認，否則可能存在一定風險；(2)對于試驗結果不敏感。本次有4家實驗室，均出現低值樣本檢測結果CV值超出5.00%，其中一家達到7.50%，5次測值結果在6.6～8.1 μmol/L內，最小值和最大值之間的偏差為22.70%。這種結果并不正常。目前全自動生化分析儀無論是國產還是進口，重復性性能理想，一般不會發生這種情況。當波動很大時，儀器檢測過程中可能處于一種并不穩定的狀態，因此必須要有一定的敏感性，及時發現存在的問題，并盡量找到原因；(3)未能合理選擇試劑盒。有4家實驗室采用了同一家進口試劑盒，3家比對樣本的結果不滿意，測值均偏高，1家雖判為滿意，但也是接近靶值的上限，這些數據表明，該試劑盒的準確度可能存在一定的問題。

穩定可靠的檢測能力是產品質量檢驗的基礎和前提，而比對試驗的結果是檢驗檢測系統質量保證能力和檢驗水平的客觀體現，通過獲得滿意結果，體現了其檢驗檢測結果的可靠性。如何在比對試驗中獲得滿意的結果，參加實驗室尤其是檢測機構，要轉換思路，應從試劑盒的性能評價轉到如何選擇合適的比對試劑上來，從考官的位置轉到考生的位置上來。筆者認為有以下幾點值得借鑒：(1)必須建立檢測系統是一個整體的概念。完整的檢測系統包括檢測儀器、配套試劑與校準品、操作程序的固定組合，而不是各部分的性能，所以應嚴格按照說明書要求，選擇檢驗適用儀器、配套試劑與校準品等，不能隨意更換某一組分，才能確保檢測結果符合廠家的性能指標，如有更改，必須進行性能確認。目前，我國生化試劑盒依然存在與進口校準品配合使用的現象，尤其是一些小企業。這種將自己的產品定值準確性完全依賴進口校準品，如若出現問題，無法從源頭上分析原因，風險較大；(2)無論選擇進口或國產試劑，在開展正式實驗前，應在操作過程無誤以及確認儀器狀態良好的情況下，采用TBIL國家或國際標準品進行準確度的確認[13-14]，如果所選試劑盒測值結果超過所允許的偏差，那么應該選擇其他合適的試劑盒，而不能憑經驗認為進口試劑質量一定優于國產試劑。本次實驗結果也證明了這一點；(3)試驗過程中應細致嚴謹，當發現結果的不穩定狀態時，應及時探尋原因，可從儀器及人員方面進行探查，包括：參數設置和光源是否正確；比色杯和吸樣針是否潔凈；實驗用水是否被污染；反應溫度是否正常；儀器是否定期校準；外部環境是否沒有干擾；實驗人員操作是否熟練等。如不能找到原因，也應更換儀器進行復測，并在復測前，采用其他樣本進行預實驗，確保儀器處于穩定的狀態。

本次比對試驗總體滿意率為77.25%，結果較滿意。參加比對試驗的實驗室主要為試劑盒質量評價的檢驗檢測機構，這些實驗室在試劑盒的注冊檢驗、上市后監督抽驗等方面發揮重要技術支撐作用。9家不滿意實驗室中，除2家為某評價中心外，有5家為省或直轄市的檢測機構和2家試劑生產企業，提示這些機構今后要特別注意加強檢驗檢測能力的提升，也進一步說明了參加比對試驗是實驗室檢測結果質量保證的重要手段，有助于實驗室評價和證明其檢測數據的可靠性，及時發現和糾正自身存在的問題。各實驗室應積極參加比對試驗，提升技術能力和實驗室管理水平。本次比對試驗為進一步加強對檢測機構、相關企業的監督管理、規范檢測市場提供了依據。