重癥肺炎患兒支氣管肺泡灌洗液中肝素結(jié)合蛋白和Th1/Th2型細胞因子的變化及臨床意義*

梁 璐，劉藝清，渠 巍，陳 敏，胡 雷，宋曉梅

貴州省貴陽市婦幼保健院檢驗科，貴州貴陽 550003

近年來肺炎已成為威脅全世界兒童健康的最常見疾病，該病進展快且預(yù)后差，即使應(yīng)用有效的抗感染和生命支持治療，死亡率仍然居高不下[1-4]。肺炎的發(fā)展除了與病原體的毒力及侵襲性相關(guān)外，與機體的免疫功能失衡亦密切相關(guān)[5]。正常情況下，機體內(nèi)的輔助性T淋巴細胞1(Th1)/Th2型細胞處于動態(tài)平衡，Th1/Th2型細胞的失衡與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后存在密切的關(guān)系[6-7]。

Th1細胞主要分泌白細胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)；Th2 細胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10等[8]；其中，外源性IL-4可促使CD4+CD45RO+前體細胞向Th2效應(yīng)細胞分化，IFN-γ則抑制前體細胞向Th2細胞分化[9]，IL-4和IFN-γ在決定CD4+CD45R0+前體細胞向Th1或Th2分化過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。

肝素結(jié)合蛋白(HBP)目前已被證實是一種能誘導(dǎo)血管滲漏和激活炎性反應(yīng)的多功能介質(zhì)[10]。急性呼吸窘迫綜合征、創(chuàng)傷后呼吸障礙、敗血癥等患者的血漿中HBP水平會顯著升高[11-12]，HBP水平的高低與疾病的嚴(yán)重程度和患者死亡率相關(guān)[13-14]。但目前關(guān)于HBP與小兒肺炎的相關(guān)性研究較少，且國內(nèi)外大部分研究通常集中于患者的血液或腦脊液樣本，鮮有研究調(diào)查肺炎患兒支氣管肺泡灌洗液(BALF)中HBP表達水平的報道。與血液樣本相比，BALF直接采集于患兒的支氣管和肺泡病變部位，可更準(zhǔn)確地反映病情。因此，本研究檢測肺炎患兒BALF中Th1/Th2型細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6及HBP的表達水平和計算IFN-γ/IL-4比值，以分析這些指標(biāo)與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性和評估患兒的免疫狀態(tài)，為臨床及時評估病情、判斷預(yù)后及免疫治療提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究選取2018年1月至2020年6月在本院就診的90例肺炎患兒為肺炎組，其中男45例，女45例,平均(4.8±0.7)歲。根據(jù)《兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(2013修訂)》標(biāo)準(zhǔn)將患者分為輕中度(n=49)和重度肺炎組(n=41)。另外，選取同期30例到本院取支氣管異物但無肺部炎癥的患兒作為對照組，其中男12例，女18例，平均年齡(3.9±1.4)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：血液疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、結(jié)核病和免疫缺陷等基礎(chǔ)疾病患者。本研究已獲得本院倫理委員會討論通過。所有樣本均經(jīng)家庭成員確認并簽署了同意書。

1.2儀器與試劑 HBP 測定試劑盒(免疫熒光干式定量法)[購自中翰盛泰生物科技公司(型號：FFHBP500,批號：HBP19S1A02F)]、干式熒光免疫分析儀(FIC-S100)[購自中翰盛泰生物科技公司(批號：FIL-S1001)]、細胞因子檢測試劑盒[購自瑞斯凱爾生物科技公司(型號：R501001、R501002、R501003、R501007，批號：191005)]、流式細胞儀(購自BD公司FACSCantoⅡ)、臺式離心機(購自長沙邁佳森儀器設(shè)備公司)。

1.3方法

1.3.1BALF的提取 兩組患兒均行胸部CT和支氣管鏡檢查。將支氣管鏡插入肺部病變區(qū)，使用注射器緩慢泵送5 mL 37 ℃預(yù)熱鹽水，并于采樣點緩慢沖洗2～3次；然后將BALF通過無菌過濾器后收集。所有BALF樣本在4 ℃下以1 500 r/min的速度離心后將上清液轉(zhuǎn)至新EP管中，并于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2HBP的檢測 首先使樣本在冰上完全解凍，然后將50 μL樣本與150 μL緩沖液充分混勻，吸取100 μL混合液加入到試劑板的加樣孔，孵育18 min，最后可直接在Jet-iStar 3000儀器上判讀結(jié)果。

1.3.3IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6水平的檢測 采取免疫分析及流式細胞儀分析結(jié)合法檢測BALF中IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6的水平。具體步驟如下：首先將實驗用試劑恢復(fù)至室溫，分別配置基質(zhì)B、校準(zhǔn)品和洗滌緩沖液；將樣本按實際情況進行適當(dāng)稀釋；其次于試管中分別加入25 μL校準(zhǔn)品和樣本，其中校準(zhǔn)品管再加入25 μL基質(zhì)B，樣本管中加入25 μL實驗緩沖液；向所有管中加入25 μL捕獲微球抗體，震蕩1 min使其充分混勻；然后，每管中各加入25 μL檢測抗體，錫箔紙包被各管，室溫避光震蕩2 h；接著于每管中加入25 μL SA-PE，錫箔紙包被各管，室溫避光震蕩0.5 h；250 g 離心5 min，吸取上清液，棄去；向每管中加入200 μL洗滌緩沖液以重懸微球；同樣，250 g 離心5 min，吸取上清液，棄去；然后向每管中加入150 μL洗滌緩沖液，通過渦旋將微球重懸，上機檢測。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各細胞因子的濃度。每個樣本設(shè)置3個重復(fù)孔。

2 結(jié) 果

2.1Th1/Th2細胞因子的表達 與對照組相比，肺炎患兒的BALF中Th1/Th2型細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6的表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。此外，重癥肺炎組患兒較輕中度肺炎組患兒的BALF中IL-2[(6.12±2.08)pg/mLvs.(2.81±0.9)pg/mL]、IFN-γ[(27.26±13.26)pg/mLvs.(12.99±4.03)pg/mL]和IL-6[(43.32±25.16)pg/mLvs.(18.59±8.55)pg/mL]的表達水平升高，且差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)；兩組患兒BALF中IL-4的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

注：A為各組Th1型細胞因子的表達水平;B為各組Th2型細胞因子的表達水平；與對照組相比，*P<0.05；與對照組相比，**P<0.05。

2.2HBP的表達 干式熒光免疫分析儀結(jié)果顯示，輕中癥肺炎組和重癥肺炎組BALF中的HBP的表達水平顯著高對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

注：與對照組相比，*P<0.01。

2.3INF-γ/IL-4比值的比較 與對照組相比，肺炎組INF-γ/IL-4比值明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)見圖3A；其中，重癥肺炎組患兒的 INF-γ/IL-4比值較輕中度肺炎患兒降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3B。

注：A為對照組與肺炎組患兒BALF中INF-γ/IL-4比值的比較;B為輕中癥肺炎組與重癥肺炎組患兒BALF中INF-γ/IL-4比值的比較；與對照組相比，*P<0.01。

3 討 論

盡管目前國內(nèi)外正不斷探索治療肺炎的新型藥物和抗菌藥物，但重癥小兒肺炎的發(fā)病率和遷移率仍在逐漸增加，抗菌藥物對該病的治療效果相對有限[15]。因此，尋找早期識別局部炎癥應(yīng)答特點和評估病情的指標(biāo)對及時治療重癥肺炎有重要意義。本研究顯示，與對照組相比，肺炎組的BALF中Th1/Th2型細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6及HBP的表達水平顯著升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中重癥肺炎組患兒較輕中度肺炎組患兒BALF中IL-2[(6.12±2.08)pg/mLvs.(2.81±0.9)pg/mL]、IFN-γ[(27.26±13.26)pg/mLvs.(12.99±4.03)pg/mL]和IL-6[(43.32±25.16)pg/mLvs.(18.59±8.55)pg/mL]的表達水平升高，差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)，表明可通過觀察這些指標(biāo)預(yù)判肺炎患兒病情及疾病進展程度。雖然本文在輕中度肺炎及重癥肺炎患兒的BALF中未觀察到IL-4的表達水平存在明顯差異(P>0.05)，但發(fā)現(xiàn)肺炎組患兒較對照組患兒的INF-γ/IL-4比值呈不同程度地增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；其中重癥肺炎組患兒的 INF-γ/IL-4比值較輕中度肺炎患兒升高程度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。該結(jié)果表明不同程度的肺炎存在不同程度的Th1/Th2型細胞因子失衡，其中重癥肺炎患兒主要存在以Th2型細胞因子為優(yōu)勢的Th1/Th2型細胞因子偏移的免疫功能紊亂。通過檢測肺炎患兒BALF中IL-2、IFN-γ、IL-4 和IL-6及HBP的表達水平，能及時準(zhǔn)確地評估患者機體免疫功能狀態(tài)和疾病的嚴(yán)重程度，為臨床預(yù)判病情和治療提供參考。本研究僅比較不同程度的肺炎患兒與無炎癥患兒BALF中的Th1/Th2型細胞因子和HBP水平的差異，尚未分析不同病原體感染患兒BALF中細胞因子和HBP水平差異及與患兒病情轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性。本團隊接下來將進一步展開研究，以期更全面、準(zhǔn)確地探討這些指標(biāo)對不同類型肺炎嚴(yán)重程度、預(yù)后及轉(zhuǎn)歸的評估價值。

正常狀態(tài)時，Th1/Th2型細胞因子處于動態(tài)平衡，共同維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)；其中，在決定CD4+CD45R0+前體細胞向Thl/Th2型細胞因子分化過程中，IL-4和IFN-γ起著重要的調(diào)節(jié)作用[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2型細胞因子失衡是引起兒童呼吸道感染的重要因素之一，且檢測Th1/Th2型細胞因子對病情有一定預(yù)測作用[16]。但目前關(guān)于肺部感染患者Th1/Th2型細胞因子的研究結(jié)果仍存在爭議。CLUTTON 等[17]認為肺部感染腺病毒的患者血漿中IL-4、IL-6的表達增高，而IFN-γ的表達降低，提示Th2型細胞因子功能亢進，機體免疫功能受抑制，從而導(dǎo)致病情進展。而MALAIYAN等[18]卻發(fā)現(xiàn)，支氣管炎患者Th2型細胞因子功能受抑制，免疫系統(tǒng)出現(xiàn)以Th1型細胞因子及其細胞因子占優(yōu)勢的Th1/Th2型細胞因子偏移。本研究結(jié)果顯示，重癥肺炎患兒主要存在以Th2型細胞因子為優(yōu)勢的Th1/Th2型細胞因子偏移，該結(jié)果與CLUTTON 等[17]的試驗結(jié)果相符。但不同類型的肺部感染可能存在不同程度和趨勢的Th1/Th2失衡，不同類型肺炎患兒的免疫狀態(tài)有待進一步確認。

研究發(fā)現(xiàn)，急性呼吸窘迫綜合征、細菌性肺炎、敗血癥等患者的血漿中HBP水平較陰性患者存顯著差異[11-12]，且其水平與疾病的嚴(yán)重程度及患者死亡率相關(guān)[13-14]。目前國內(nèi)外大部分研究均集中于分析細菌性腦膜炎患者的腦脊液[19]或尿路感染患者的尿液樣本[20]中HBP水平的變化，關(guān)于肺部感染患者BALF中HBP的表達研究仍然很少，本研究首次通過檢測重癥肺炎患兒BALF中HBP、Th1/Th2型細胞因子的表達水平和IFN-γ/IL-4的比值，以觀察肺炎患兒體內(nèi)輔助性T細胞亞群Th1、Th2細胞的變化特點和評估患兒的免疫功能狀況，有助于積極預(yù)防肺炎患兒的病情進展，對臨床降低患兒死亡率有一定的積極意義。