高血壓左心室肥厚患者血清miR-21、TGF-β1表達及臨床意義*

吳立國，高景芳，張書春，夏 娟

1.唐山南湖醫院心血管內科，河北唐山 063000；2.唐山工人醫院心內二科，河北唐山 063000

高血壓是心血管疾病常見的危險因素，可導致器官損害和功能障礙，特別是對心臟射血功能造成巨大負荷。長期的高血壓會增加左心室負荷，使左心室形態、結構及功能發生改變，導致左心室肥厚[1]。高血壓左心室肥厚發病機制目前還沒有明確，有學者認為心肌纖維化、心肌細胞凋亡可能與高血壓左心室肥厚的發病機制有關[2]。目前研究結果發現，微小RNA(miRNA)可調控高血壓及其相關疾病的基因表達[3-4]。miR-21作為一類新型內源性調節因子，可促進心肌纖維化進展[5]。多種生長因子對左心室肥厚的形成具有不可替代的作用，其中轉化生長因子-β1(TGF-β1)是最有效、最普遍的調節心肌肥厚、促纖維生成的細胞因子[6]。已有研究證實，miR-21可通過靶向抑制信號轉導蛋白7(Smad7)，從而促進TGF-β1誘導心肌纖維化[7]。但關于miR-21和TGF-β1在高血壓左心室肥厚的形成中作用的報道較少見。因此本研究將探討miR-21和TGF-β1在高血壓左心室肥厚患者血清中的表達水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年10月至2020年10月唐山南湖醫院心血管內科收治的原發性高血壓患者122例作為研究對象，其中男64例，女58例，年齡48～70歲，平均(60.04±6.08)歲，病程5～16年，平均(11.57±3.01)年。收集患者入院靜坐時收縮壓、靜坐時舒張壓數據。納入標準：(1)符合《中國高血壓防治指南(2018年修訂版)》中的診斷標準[8]；(2)愿意配合此次試驗者；(3)入選患者了解本次研究，并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并有惡性腫瘤患者；(2)除高血壓外，患者有明確的心血管疾病史；(3)患者有自身免疫性疾病、造血系統疾病等。本研究通過唐山南湖醫院倫理委員會批準。

1.2左心室肥厚判定方法 所有患者均由一名有經驗的醫師采用GE LOGIQ F Series型彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司)(探頭頻率10～12 MHz)測量室間隔厚度(IVST)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)和左心室后壁厚度(LVPWT)。根據Devereux校正公式：計算左心室質量(LVM)，LVM=0.8×1.04×[(IVST+LVEDD+LVPWT)3-LVEDD3]+0.6。收集患者身高、體質量數據，根據身高和體質量計算體表面積(BSA)，計算公式：BSA(女)=0.007 3×身高+0.012 7×體質量-0.210 6；BSA(男)=0.005 7×身高+0.012 1×體質量+0.088 2；BSA單位是m2，身高單位是cm，體質量單位是kg。根據BSA計算左心室質量指數(LVMI)，LVMI=LVM/BSA。以男性LVMI≥115 g/m2，女性LVMI≥95 g/m2為判定左心室肥厚的判定標準[9]。本研究中高血壓患者根據是否發生左心室肥厚分為左心室肥厚組35例和非左心室肥厚組87例。

1.3試劑及儀器 RNA提取試劑盒(批號R1200-100)購自北京索萊寶科技有限公司；逆轉錄試劑盒(批號QR0100)、熒光定量PCR試劑盒(2×SYBR Green qPCR Mix)(批號RR047A)、熒光定量PCR參比染料(ROX Reference Dye)(批號RS109)均購自日本Takara公司；人TGF-β1酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號DB100B)購自美國R&D公司；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(型號CFX96)、酶聯免疫檢測儀(型號680)均購自美國Bio-Rad公司。

1.4研究方法

1.4.1樣品采集 采集所有患者清晨空腹靜脈血5 mL裝于普通采血管中，4 ℃，3 000 r/min，離心8 min，留上清液，凍存于-80 ℃冰箱中，待測。

1.4.2熒光定量PCR檢測血清中miR-21的表達 使用RNA提取試劑盒提取樣品中總RNA，檢測所得RNA純度，總RNA依照逆轉錄試劑盒，反轉錄為cDNA。采用qRT-PCR儀對miR-21及內參U6進行擴增反應，miR-21正向引物5′-AAA GTT GTA GTC AGA CTA TTC GAT-3′，反向引物5′-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT-3′。內參U6正向引物5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′，反向引物5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。引物由北京索萊寶科技有限公司合成。qRT-PCR反應體系20 μL：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，正向和反向引物各2 μL，cDNA模板(50 ng/μL)1 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 4.6 μL。反應條件：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；38個循環。對miR-21相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.4.3檢測血清中TGF-β1水平 采用ELISA法檢測血清中TGF-β1水平，操作步驟嚴格依據ELISA試劑盒說明書進行操作。

2 結 果

2.1左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者基線資料比較 左心室肥厚組和非左心室肥厚組在性別、年齡上比較差異無統計學意義(P>0.05)；與非左心室肥厚組相比，左心室肥厚組患者高血壓病程、靜坐時收縮壓、靜坐時舒張壓較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者基線資料比較

2.2左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI水平比較 與非左心室肥厚組相比，左心室肥厚組患者IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI水平較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI水平比較

2.3左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者血清miR-21和TGF-β1水平比較 與非左心室肥厚組相比，左心室肥厚組患者血清miR-21、TGF-β1水平較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 左心室肥厚組和非左心室肥厚組患者血清miR-21和TGF-β1水平比較

2.4高血壓患者血清miR-21、TGF-β1與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI的相關性分析 Pearson相關性分析顯示，高血壓患者血清miR-21與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI呈正相關關系(P<0.05)，血清TGF-β1與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI呈正相關關系(P<0.05)。見表4。

表4 高血壓患者血清miR-21、TGF-β1水平與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI的相關性分析

2.5血清miR-21、TGF-β1及兩者聯合對高血壓左心室肥厚診斷價值分析 繪制ROC曲線結果顯示，miR-21、TGF-β1單項及聯合檢測診斷高血壓左心室肥厚的曲線下面積(AUC)分別為0.882(95%CI：0.812～0.952)、0.847(95%CI：0.772～0.922)、0.947(95%CI：0.908～0.987)。見表5和圖1。

表5 血清miR-21、TGF-β1及兩者聯合對高血壓左心室肥厚診斷價值

圖1 ROC曲線分析血清miR-21、TGF-β1單項及聯合檢測對高血壓左心室肥厚的診斷價值

3 討 論

高血壓是一種全身性慢性疾病，主要表現為體循環動脈血壓升高。早期血壓控制不好，持續升高，會使左心室心肌持續處于超負荷工作狀態，導致左心室代償性肥厚發生。另有報道顯示，長期心臟壓力負荷會刺激成纖維細胞增殖、心肌細胞胞外基質膠原過度沉積，最終導致心肌纖維化，促進左心室肥厚[10]。據報道，高血壓患者發生左心室肥厚的概率為20.00%～30.00%，心室肥厚是心臟事件致死及全因死亡的獨立危險因素[11]。分析左心室肥厚形成的機制有助于高血壓左心室肥厚的診斷和治療。

心肌成纖維細胞的增殖和心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化是心肌纖維化的關鍵。TGF-β是結構和功能相關的多肽生長因子，可調節細胞的生長和分化，一共有5種亞型。目前哺乳動物中有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。TGF-β1位于19q13染色體上，在體細胞系中分布最廣泛、活性最強。TGF-β與多種疾病的發病機制相關，如肺纖維等纖維化疾病[12]。TGF-β1是心肌纖維化的主要調節因子，可通過TGF-β1/Smad信號通路減少細胞外基質降解，促進Ⅰ型膠原等蛋白合成，促進成纖維細胞分化[13]。夏勇等[14]報道高血壓粥樣硬化斑塊患者和增厚患者TGF-β1水平明顯高于頸動脈正常的高血壓患者；高血壓左心室肥厚患者TGF-β1水平明顯高于無左心室肥厚患者，同時發現TGF-β1與LVMI水平呈正相關關系，表明TGF-β1與高血壓患者左心室肥厚有關。本研究發現左心室肥厚組患者血清TGF-β1水平顯著高于非左心室肥厚組患者，提示TGF-β1可能與高血壓左心室肥厚發生有關系，進一步發現血清TGF-β1與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI呈正相關關系，進一步證實了TGF-β1可能參與高血壓左心室肥厚的發生。ROC曲線分析發現血清TGF-β1對高血壓左心室肥厚診斷的AUC為0.847，靈敏度為81.40%，特異度為78.50%，提示TGF-β1在臨床上對高血壓左心室肥厚的評估可能比較可靠。

miRNA是一類長度19～25個核糖核苷酸的單鏈小分子RNA，常作為內源性調節因子參與心臟疾病的發生過程，包括心肌纖維化[15]。與心肌纖維化有關的幾種miRNAs中，miR-21因其靶點在腎、肝等多個器官的纖維化中發揮重要作用而受到特別關注[16-17]。人miR-21位于染色體17q23.2區域，與其他miRNA不同，其有獨立的啟動子區域。ZHOU等[18]在大鼠實驗中發現miR-21能夠靶向降解Jagged1蛋白，促進心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化和心肌纖維化形成。薛貽敏等[19]在小鼠實驗中發現，miR-21可促進慢性病毒性心肌炎小鼠心肌纖維化，這一過程是通過介導TGF-β1/Smad7信號通路實現的。孟華等[20]報道miR-21通過抑制Smad7表達，增強心臟成纖維細胞的增殖，加重心肌梗死后心肌纖維化，表明miR-21是作用于成纖維細胞，促進心肌纖維化，而非作用于心肌細胞本身，推測miR-21可能參與高血壓左心室肥厚的心肌纖維化過程。周湘鴻等[21]報道高血壓左心室肥厚患者miR-29b水平明顯高于高血壓非左心室肥厚患者，與高血壓左心室肥厚呈正相關關系。本研究發現左心室肥厚組患者血清miR-21水平顯著高于非左心室肥厚組患者，提示miR-21可能參與高血壓左心室肥厚發生，猜測miR-21是通過促進成纖維細胞心肌纖維化，促進高血壓患者左心室肥厚的發生。本研究發現血清miR-21與IVST、LVEDD、LVPWT、LVMI呈正相關關系，證實了miR-21與高血壓患者的左心室肥厚發生具有緊密聯系。ROC曲線分析發現miR-21對高血壓左心室肥厚診斷的AUC為0.882，靈敏度為74.40%，特異度為92.40%；血清miR-21和TGF-β1聯合對高血壓左心室肥厚診斷的AUC為0.947，靈敏度為95.30%，特異度為83.50%，兩者聯合診斷的AUC顯著高于單獨診斷時AUC，提示兩者聯合檢測對高血壓左心室肥厚診斷效果可能更好。本研究從臨床上分析了miR-21和TGF-β1對高血壓左心室肥厚的評估價值，為預測高血壓患者是否發生左心室肥厚提供了理論基礎，為高血壓左心室肥厚疾病在醫學上的研究進展奠定基礎。

綜上所述，高血壓左心室肥厚患者血清miR-21和TGF-β1水平上調，兩者對高血壓左心室肥厚具有較好的評估價值，兩者聯合診斷效果更好。