血清miR-124、miR-155聯合miR-23檢測在超早期腦梗死診斷中的應用價值*

張立娜,王海虹,王適達

河北省保定市第二中心醫院:1.老年病科;2神經內2科;3.功能科，河北保定 072750

腦血栓形成是最常見的梗死類型，以動脈粥樣硬化所致的腦局灶性梗死及相應神經系統病變，屬于臨床急癥，多發于50歲以上老年人群，且女性發病率高于男性[1]。相關調查顯示，飲食不當、糖尿病、高血壓、血脂疾病是導致腦梗死發生的主要危險因素，其具有較高的致死、致殘風險；臨床上將發病6 h以內的腦梗死情況稱為超早期腦梗死[2-3]。臨床資料顯示，在發病后6 h內快速診斷及治療，對患者預后及生存率提高具有重要作用。因此，早期診斷對患者治療及預后具有重要意義[4]。相關研究指出，在腦血栓形成過程中，存在分子成分與血流流變學變化。微小RNA(miRNA)能夠對基因表達起到調節作用，參與細胞生長、分化等過程，并在不同病理、生理過程中呈現不同的表達，對某些疾病的診斷及預測具有重要意義。同時，相關研究證實，miRNA能夠調控血管內皮細胞功能，參與平滑肌細胞轉化過程，與血管疾病的發生、發展具有密切聯系[5-6]。為探討miR-124、miR-155、miR-23在超早期腦梗死患者中表達的臨床意義，本研究對血清miR-124、miR-155、miR-23水平進行了檢測，分析了其對超早期腦梗死診斷和預后的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年2 月至2020年2月在本院接受超早期腦梗死治療的患者91例作為腦梗死組，同時選取同期在本院體檢的91例體檢健康者作為體檢健康組。腦梗死組中男54例，女37例，年齡47～60歲，平均(53.5±5.5)歲，平均體質量指數(BMI)(25.16±1.27)kg/m2；其中小面積梗死40例、中面積梗死33例、大面積梗死18例(按照PullICino公式計算腦梗死面積，腦梗死面積=π/6×長×寬×CT掃描陽性層數層面；梗死面積<5 cm2為小梗死；梗死面積≥5 cm2且≤10 cm2為中梗死；大梗死面積為>10 cm2)，根據動脈粥樣硬化(CAS)斑塊性質，分為易損斑塊患者53例，穩定斑塊患者38例。并根據Rankin量表(MRS)評分評估患者神經損傷程度并分為預后良好組(n=64)及預后不良組(n=27)，MRS評分≤2分表示預后良好，MRS評分3～4分表示預后不良。體檢健康組中男51例，女40例，年齡50～61歲，平均(55.5±4.6)歲，BMI(25.31±2.01)kg/m2。所有研究對象一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。對本研究的內容患者及家屬均知情并同意，本研究獲得本院倫理委員會批準。納入標準：(1)所有患者均符合中華醫學會腦梗死診斷標準[7]；(2)均經過腦部CT、磁共振成像檢查證實；(3)患者腦梗死發病時間為6 h以內，且腦梗死為初次發病。排除標準：(1)病歷資料不全者；(2)惡性腫瘤患者；(3)合并心、肝、腎等嚴重系統性疾病；(4)短暫性腦缺血發作或合并腦出血等疾病；(5)患有血液疾病患者。(6)有腦梗死既往史者。

1.2觀察指標 抽取所有研究對象住院次日或體檢當日空腹靜脈血液6 mL，以3 000 r/min離心10 min，靜置分離上層血清，于-75 ℃環境下保存待檢。實時熒光定量PCR檢測miR-124、miR-155、miR-23表達量。提取細胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉錄處理后獲得cDNA，使用Primer5.0軟件設計引物，采用2-ΔΔCt方法計算，內參為U6。設置反轉錄反應條件：25 ℃ 10 min,40 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min；設置擴增條件:94 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s,35個循環，采用2-ΔΔCt方法計算miR-124、miR-155、miR-23的相對表達水平。miR-124引物序列為上游引物：5′-GCT AAG GCA CGC GGT G-3′，下游引物：5′-GTG CAG GTC CGA GGT-3′。miR-155引物序列為上游引物：5′-CGT TAA TGC TAA TCG TGA TAG-3′,下游引物：5′-GCA GGG TCC GAG GT-3′。miR-23引物序列為上游引物：5′-TCA CAC TAT ATC ACA TTG CCA GG-3′，下游引物：5′-TAT GGT TGT TCT GCT CTC TGT CTC-3′。U6引物序列為上游引物：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,下游引物：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。

1.3診斷效能分析 對各項檢查的靈敏度、特異度和準確度進行統計。靈敏度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%。特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%。準確度=(真陽性例數+假陽性例數)/總例數×100%。

1.4統計學處理 采用SPSS21.0統計學軟件進行分析。多組間計量資料的比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗;組間比較采用獨立樣本t檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1miR-124、miR-155、miR-23在體檢健康組、腦梗死組中的表達水平比較 與體檢健康組相比，腦梗死組血清中miR-124表達水平較低，miR-155、miR-23表達水平較高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 miR-124、miR-155、miR-23在體檢健康組、腦梗死組中的相對表達水平比較

2.2不同梗死面積、神經缺損程度、CAS斑塊性質患者miR-124、miR-155、miR-23表達的水平比較 隨梗死面積的增加，miR-124表達水平降低，miR-155、miR-23表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；隨神經缺損程度增加，miR-124水平降低，miR-155、miR-23水平升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與易損斑塊患者相比，穩定斑塊患者miR-124水平較高，miR-155、miR-23水平較低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同梗死面積、神經缺損程度、CAS斑塊性質患者血清miR-124、miR-155、miR-23相對表達水平比較

2.3不同預后狀態患者血清miR-124、miR-155、miR-23表達水平比較 與預后良好組相比，預后不良組miR-124表達水平較低、miR-155、miR-23表達水平較高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同預后狀態患者血清miR-124、miR-155、miR-23相對表達水平比較

2.44種檢測手段靈敏度、特異度及準確度比較 miR-124檢測的靈敏度、特異度和準確度分別為71.43%、70.33%、70.87%，miR-155檢測的靈敏度、特異度和準確度分別為69.23%、70.33%、69.78%，miR-23檢測的靈敏度、特異度和準確度分別為74.72%、79.12%、76.92%，三者聯合檢測的靈敏度、特異度和準確度分別為95.60%、94.51%、95.05%。與miR-124檢測相比，miR-155檢測的靈敏度、特異度和準確度略低，miR-23的靈敏度、特異度和準確度略高，但差異無統計學意義(P>0.05)；與miR-124、miR-155、miR-23單獨檢測相比，三者聯合檢測的靈敏度、特異度和準確度較高，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 4種檢測手段靈敏度、特異度及準確度比較(%)

2.5單獨檢測與聯合檢測腦梗死多因素Logistic回歸分析 單獨檢測與聯合檢測腦梗死多因素Logistic回歸分析，結果顯示血清miR-124異常表達與超早期腦梗死呈負相關關系，血清miR-155、miR-23呈正相關關系。見表5。

表5 單獨檢測與三者聯合檢測腦梗死多因素Logistic回歸分析

3 討 論

超早期腦梗死是指發病時間在6 h內的患者，快速確診治療，能有效降低并發癥及后遺癥的發生，是腦梗死治療的關鍵，對生存率具有嚴重的影響[5]。相關研究顯示，隨著我國人口老齡化加重，腦梗死發病率呈逐年上升趨勢，若未及時診斷及接受有效地治療，導致炎性反應、氧化應激反應等缺血及聯病理事件的發生，會嚴重威脅患者生命健康及生活質量。因此，及時得到有效診斷對患者的治療及預后具有重要意義[7]。

目前，臨床主要通過頭顱CT、MRI等影像學手段對腦梗死患者進行診斷，但其診斷準確性欠佳[8]。隨著近年來醫學技術的發展，RNA診斷在臨床眾多疾病診斷中得到廣泛應用。相關研究顯示，miRNA具有組織特異性高、相對穩定性及體液豐度高等特點，能夠通過抑制轉錄、降解miRNA，達到對靶基因轉錄水平調節作用，介導血管生成、凋亡及氧化應激的目的，可作為潛在性組織損傷生物標志物[9-10]。

作為腦部特異性的miRNA，miR-124在腦部神經發育及調控中樞神經功能中具有重要作用[11]。相關資料顯示，miR-124在動物模型中作為缺血性腦損傷標志物。在建模8 h后，miR-124表達升高，腦損傷發生，24 h達到峰值，可在48 h后仍保持高表達水平，通過抑制細胞凋亡、降低炎性反應達到保護神經元及腦部組織目的[12]。說明miR-124可以作為腦梗死早期檢測的生物標志物[13]。有研究通過觀察缺血性腦卒中小鼠腦部梗死面積發現，miR-124基因與腦梗死體積之間存在密切聯系[12]。本研究結果顯示，miR-124表達水平的檢測對超早期腦梗死患者預后及診斷具有重要意義。

動脈粥樣硬化是腦梗死的重要病理基礎。相關研究發現，miR-155在內皮細胞過表達與抑制內皮細胞增殖或遷移與再內皮化，導致血管通透性增加，誘發動脈粥樣硬化。另外，還會通過擾亂巨噬細胞加劇早期動脈粥樣硬化[14]。miR-155作為miRNA家族中的重要一員，不僅對動脈粥樣硬化具有重要意義，同時在腦梗死發生后參與血運重建與神經元變性[15]。相關資料表明，miR-155屬于多功能miRNA，參與細胞生長、代謝、炎癥等多種生物過程，可多角度對腦梗死的發生發展進行調控。在健康人群中miR-155表達明顯低于腦梗死患者，miR-155可能是新型腦梗死的生物標志物[16-17]。本研究結果顯示，血清miR-155檢測對超早期腦梗死診斷及預后判斷有重要意義。

miR-23在基因層面參與機體各方面病理進程，成為新的研究熱點，其對機體的調節體現在多方面、多組織。相關研究發現，少突膠質細胞發育、髓鞘形成與miR-23表達具有密切關系[18]。miR-23在心血管系統疾病中存在高表達，與心血管疾病的發生發展具有密切聯系。本研究結果顯示，對血清miR-23水平進行檢測對超早期腦梗死預后判斷有一定價值。

氧化應激、炎性反應、細胞凋亡導致缺血性腦卒中的病理損傷，造成神經細胞受損。miR-124、miR-155、miR-23通過參與調控過程，對疾病預后造成影響。三者聯合檢測靈敏度更高、特異度更強，診斷價值更高，3種因子表示不同時段的病理變化，對不同時段的腦梗死具有很好的診斷效能[19]。通過為期1年的隨訪發現，miR-124、miR-155、miR-23異常表達與患者生存率之間存在密切關聯，聯合檢測結果為陽性患者，病死率明顯高于陰性患者。局部微循環在腦梗死后持續惡化誘導神經細胞凋亡，是導致梗死面積變化及神經元損傷的重要病因，同時誘導炎癥因子聚集，炎性反應發生，進一步造成腦損傷的加重。相關研究表示，miR-124、miR-155、miR-23可能共同參與整個疾病的生理過程，其表達對炎性反應及細胞凋亡可能造成影響，對患者預后產生重要影響[20]。本文研究結果顯示，通過對血清miR-124、miR-155、miR-23進行聯合檢測，能夠對患者預后情況做出有效評估。

綜上所述，對血清miR-124、miR-155、miR-23進行聯合檢測，可有效評估患者的梗死面積、神經受損程度及CAS斑塊進行定義，同時對超早期腦梗死診斷及預后提供重要參考價值。