C3-差向異構(gòu)體測(cè)定對(duì)評(píng)估未成年人體內(nèi)維生素D貯存的重要性*

何益洋，李園夢(mèng)，徐 鵬，馮 倩，蔣文強(qiáng)，俸家富△

1.四川省綿陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川綿陽(yáng) 621000；2.四川省南充市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川南充 637000；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，四川成都 610075

維生素D(VitD)是一類脂溶性固醇類衍生物，25羥維生素D[25(OH)D]是主要儲(chǔ)存形式，包括25(OH)D2和25(OH)D3(本文簡(jiǎn)稱VitD2和VitD3)[1-2]。VitD2和VitD3分別來(lái)源于植物和動(dòng)物。有研究認(rèn)為應(yīng)同時(shí)檢測(cè)VitD2和VitD3以保證兩種來(lái)源的VitD均能被檢出[3]。C3-差向異構(gòu)體(C3-epi)是VitD2和VitD3在酶作用下形成的同分異構(gòu)體。因此，評(píng)價(jià)機(jī)體內(nèi)VitD貯存，僅檢測(cè)總25(OH)D水平，或僅分別檢測(cè)VitD2和VitD3是不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)的，尤其是對(duì)于未成年受試者，因其肝腎臟功能尚未成熟，導(dǎo)致VitD代謝途徑向差向異構(gòu)體分流[4]。本實(shí)驗(yàn)室引入超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)，嘗試檢測(cè)了部分受試者VitD2與VitD3水平，并分析了C3-epi對(duì)結(jié)果的影響，以期為臨床評(píng)估未成年人(某些VitD相關(guān)性疾病)體內(nèi)VitD貯存提供可靠的循證依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年6—8月來(lái)綿陽(yáng)市中心醫(yī)院就診或健康體檢的未成年人(<18歲)1 671例，年齡1個(gè)月至16歲，中位年齡12歲。分為健康組(n=1 204)和疾病組(n=467)，疾病組為隨機(jī)抽取的就診患兒，包括矮小癥134例、呼吸道感染215例、營(yíng)養(yǎng)不良57例和抽動(dòng)障礙61例。

1.2樣本檢測(cè) 受試者禁食過(guò)夜，于上午10點(diǎn)前，用一次性含分離膠/纖維蛋白酶促凝劑真空采血管(美國(guó)BD 公司)采集空腹靜脈血約5 mL，輕輕顛倒混勻，靜置0.5～1.0 h后，以3 000 r/min 離心10 min，分離血清，-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｓ肑asperTMHPLC液相色譜儀與AB SCIEX Triple QuadTM4500MD型質(zhì)譜儀串聯(lián)，檢測(cè)血清中VitD組分含量。實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)及儀器參數(shù)設(shè)置：(1)校準(zhǔn)品。25(OH)D2(同位素?fù)饺搿?8.0%,純度≥95.0%)、25(OH)D3(≥99.0%,≥95.0%)和3-epi-25(OH)D3-[2H3](≥98.0%,≥98.0%)購(gòu)自美國(guó)IsoSciences MPD化學(xué)公司；25(OH)D2-D6和25(OH)D3-D6購(gòu)自美國(guó)Medical isotopes公司，二者豐度和化學(xué)純度都分別為 > 98.0%(atom)D和>99.0%；3-epi-25-(OH)D3購(gòu)自加拿大Toronto research chemical公司，純度95.0%。(2)樣本處理。向200 μL血清中加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，充分混勻后加入1.0 mL叔丁基甲醚，以13 000 r/min高速離心5 min，吸取上清液800 μL于潔凈的埃彭多夫管中，并吹干。然后向殘余物中加入100 μL含0.1%甲酸的65.0%甲醇溶液，使之復(fù)溶，充分混勻后待測(cè)。(3)色譜條件。采用C18色譜柱(Phenomenex，美國(guó))進(jìn)行樣本分離，柱溫為40 ℃，流速為0.6 mL/min。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脫。(4)質(zhì)譜條件。采用APCI離子源進(jìn)行質(zhì)譜分析；駐留時(shí)間為40 ms；掃描模式采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；VitD2、D6-25(OH)D2、VitD3和D6-25(OH)D3的離子對(duì)(母離子/定量子離子)分別為395.3/269.2 m/z、419.3/229.3 m/z、383.3/365.3 m/z和389.3/363.3 m/z；監(jiān)測(cè)VitD2、D6-25(OH)D2、VitD3和D6-25(OH)D3所使用的去簇電壓分別為110 V、85 V、130 V和130 V，碰撞能量分別為24 eV、21 eV、16 eV和19 eV。(5)數(shù)據(jù)采集：色譜圖輸出用Analyst?MD軟件(版本號(hào)：1.6.3)，數(shù)據(jù)處理用MultiquantTMMD軟件(版本號(hào)：3.0.2)，二者均是AB SCIEX Triple QuadTM4500MD質(zhì)譜儀(ABI，美國(guó))配套操作系統(tǒng)。

1.3C3-epi分析 隨機(jī)抽取87例樣本，包括健康者24例，不同疾病患者63例。用同位素稀釋超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行3-epi-25(OH)D3，即C3-epi檢測(cè)。

1.4VitD組分水平的計(jì)算 根據(jù)液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)得的VitD2和VitD3結(jié)果，計(jì)算出25(OH)D=VitD2+VitD3；由于VitD3是VitD2活性的2～3倍，以最高活性3倍計(jì)算，將VitD2折算為VitD3，再加上VitD3的活性，合并為AVitD3。活性VitD3(AVitD3)=VitD2/VitD3+VitD3。

1.5VitD營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的評(píng)估 根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)研究所(IOM)推薦[5]，VitD營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)為≤20 ng/mL為缺乏；20～<30 ng/mL為不足；≥30 ng/mL為充足。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。因本研究的VitD組分水平不服從正態(tài)分布，所測(cè)結(jié)果以M(P25～P75)進(jìn)行描述。比較健康組與疾病組指標(biāo)的差異，選擇Mann-WhitneyU檢驗(yàn)；比較多組間指標(biāo)的差異，選擇Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonferroni法(即調(diào)整α水準(zhǔn)法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1受試者血清VitD組分水平 受試者VitD2、VitD3、25(OH)D和AVitD3水平見表1。因本組資料均不呈正態(tài)分布，用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)對(duì)健康組和疾病組兩組差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，疾病組的血清VitD2水平、血清VitD3水平、25(OH)D水平和AVitD3水平均明顯低于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2受試者血清VitD2和VitD3水平 受試者中，VitD2水平從高至低依次為抽動(dòng)障礙組、健康組、呼吸道感染組、矮小癥組和營(yíng)養(yǎng)不良組，中位值水平分別為1.96、1.91、1.61、1.44 ng/mL 和0.99 ng/mL，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Bonferroni法兩兩比較，營(yíng)養(yǎng)不良組血清VitD2水平明顯低于健康組和抽動(dòng)障礙組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。受試者中，VitD3水平由高至低依次為健康組、呼吸道感染組、營(yíng)養(yǎng)不良組、矮小癥組、抽動(dòng)障礙組，中值水平依次分別為：29.48、28.48、25.89、25.64、24.73 ng/mL，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Bonferroni法兩兩比較，矮小癥組和抽動(dòng)障礙組血清VitD3水平均明顯低于健康組和呼吸道感染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3受試者血清25(OH)D和AVitD3水平 受試者中，25(OH)D水平由高至低依次為健康組、呼吸道感染組、抽動(dòng)障礙組、矮小癥組和營(yíng)養(yǎng)不良組，見表2，中位值水平分別為34.29、33.21、30.04、28.14、27.51 ng/mL，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Bonferroni法兩兩比較，矮小癥組、營(yíng)養(yǎng)不良組和抽動(dòng)障礙組血清25(OH)D水平均明顯低于健康組，而且矮小癥組血清25(OH)D水平還明顯低于呼吸道感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

受試者中，AVitD3水平由高至低依次為健康組、呼吸道感染組、抽動(dòng)障礙組、矮小癥組和營(yíng)養(yǎng)不良組，中值水平分別為30.91、30.19、26.56、26.47、26.07 ng/mL，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Bonferroni法兩兩比較，矮小癥組和抽動(dòng)障礙組血清AVitD3水平均明顯低于健康組，而且矮小癥組血清AVitD3水平還明顯低于呼吸道感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4C3-epi分析 本研究用同位素稀釋質(zhì)譜法評(píng)估了87個(gè)血清樣本C3-epi水平，通過(guò)調(diào)整質(zhì)譜條件和更換色譜柱，實(shí)現(xiàn)C3-epi和VitD3色譜峰的有效分離，見圖1。結(jié)果顯示，VitD3和C3-epi分別在3.39 min和3.47 min洗脫，洗脫時(shí)間非常接近；同時(shí)C3-epi的質(zhì)譜峰與VitD3密切相關(guān)。然后，在引入C3-epi標(biāo)準(zhǔn)品和同位素內(nèi)標(biāo)之后，采用正離子條件下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，實(shí)現(xiàn)對(duì)C3-epi同位素內(nèi)標(biāo)法定量，見表3。因本組資料均不呈正態(tài)分布，用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)對(duì)健康組和疾病組兩組差異進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，隨機(jī)抽樣的血清樣本中，疾病組的VitD2、VitD3和25(OH)D水平明顯高于健康組，而疾病組的VitD2/VitD3與健康組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這些改變均與總體血清樣本的改變一致；但是疾病組的血清C3-epi水平明顯高于健康組，其與VitD3的比值(即C3-epi/VitD3)在疾病組和健康組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而其與25(OH)D的比值[即C3-epi/25(OH)D]疾病組低于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：C3-epi的質(zhì)譜峰與VitD3密切相關(guān)，洗脫時(shí)間非常接近。VitD3和C3-epi分別在3.39 min和3.47 min洗脫。

2.5受試者體內(nèi)VitD營(yíng)養(yǎng)狀態(tài) 用25(OH)D水平分析本組受試者機(jī)體VitD貯存狀況，因?yàn)槭窍募荆偌由蟽和赡苡幸庾R(shí)地補(bǔ)充了VitD，從圖2可見，65.4%健康組和52.7%疾病組受試者VitD充足，疾病組中VitD充足者比例低于50%的是矮小癥(41.8%)和營(yíng)養(yǎng)不良患者(43.9%)。但是，由于VitD2活性僅是VitD3活性的1/3～1/2，因此將VitD2活性折算為AVitD3水平用于分析后發(fā)現(xiàn)，僅健康組(53.2%)和呼吸道感染組(51.2%)有剛過(guò)一半的受試者VitD貯存充足，而矮小癥(30.6%)和抽動(dòng)障礙患者(31.2%)中VitD貯存充足者不足1/3，其VitD缺乏或不足超過(guò)者分別占69.4%和68.8%。

將本研究受試者VitD營(yíng)養(yǎng)狀況繪成圖，按25(OH)D判斷，見圖2A；按AVitD3判斷，見圖2B。

注：A為25(OH)D判斷；B為AVitD3判斷。

3 討 論

VitD缺乏已成為全球的公共衛(wèi)生健康問(wèn)題，越來(lái)越多的研究者們對(duì)VitD水平的關(guān)注已不僅僅局限于營(yíng)養(yǎng)學(xué)，而是對(duì)很多疾病的構(gòu)成比，如心臟病、腎病、肺病、癌癥、糖尿病、高血壓、精神分裂癥和自身免疫性疾病等的發(fā)生發(fā)展、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估的意義都在進(jìn)行廣泛的探索[2,6-11]。但是，鑒于早些年醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室VitD檢測(cè)技術(shù)的局限，這些研究多集中在某種疾病與25(OH)D水平關(guān)系的層面，而對(duì)VitD組分的組成、測(cè)定及其與疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，研究報(bào)道較少。

本研究用UHPLC-MS/MS技術(shù)分析了未成年人中健康受試者和某些種類疾病患者血清VitD組分。疾病組血清VitD2、VitD3和25(OH)D水平均較健康組降低。說(shuō)明未成年人在疾病發(fā)生后可能導(dǎo)致體內(nèi)VitD水平下降，當(dāng)然也可能是機(jī)體VitD水平較低導(dǎo)致疾病發(fā)生。雖然還沒能證明VitD是一種抗氧化劑，但VitD能調(diào)節(jié)多條合成抗氧化物質(zhì)的細(xì)胞通路，對(duì)抗活性氧自由基和一氧化氮的氧化作用，防止組織細(xì)胞氧化損傷[12]。因此，如若機(jī)體內(nèi)VitD長(zhǎng)期維持在較低水平，個(gè)體對(duì)抗ROS的能力就將下降，組織細(xì)胞被氧化損傷的可能性增加，導(dǎo)致疾病發(fā)生和發(fā)展概率增加。另一方面，大多數(shù)疾病都與炎癥相關(guān)，機(jī)體抗炎性反應(yīng)必然消耗抗氧化劑，這可能就是發(fā)生疾病時(shí)體內(nèi)VitD水平降低的原因之一。

由于人體血液中VitD2及其代謝產(chǎn)物與VitD結(jié)合蛋白相結(jié)合的能力比VitD3低，加之VitD2存在一個(gè)非生理代謝形式，且其半衰期較VitD3短，VitD2的生物效力明顯低于VitD3，這些因素使得VitD3實(shí)際存儲(chǔ)VitD的能力要比VitD2高2～3倍[1,13]。因此，生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)VitD3水平遠(yuǎn)高于VitD2水平，VitD2/VitD3比值極低。受試者因某些不明原因?qū)е麦w內(nèi)VitD2水平過(guò)高而VitD3卻明顯降低時(shí)，若僅檢測(cè)血清25(OH)D水平，就可能導(dǎo)致VitD貯存充足的假象。對(duì)本組受試者的研究顯示，經(jīng)VitD2向AVitD3折算后，以AVitD3水平再進(jìn)行體內(nèi)VitD營(yíng)養(yǎng)狀況評(píng)估時(shí)，本組受試者中無(wú)論健康與否，其VitD中位數(shù)水平均有明顯下降。這可能就是檢測(cè)血清VitD濃度時(shí)，需檢測(cè)其組分的真正理由所在，因?yàn)橹挥羞@樣才能正確評(píng)價(jià)受試者體內(nèi)VitD營(yíng)養(yǎng)水平。然而，關(guān)于對(duì)機(jī)體內(nèi)VitD貯存的評(píng)價(jià)，現(xiàn)在臨床實(shí)驗(yàn)室?guī)缀醵际鞘褂妹庖邩?biāo)記技術(shù)(即化學(xué)發(fā)光法)來(lái)檢測(cè)血清總25(OH)D水平，其結(jié)果不僅只是將VitD2與VitD3的生物活性等同，而且還忽視了樣本中C3-epi的存在，顯然這樣的評(píng)價(jià)方式極為不當(dāng)甚至是錯(cuò)誤的認(rèn)識(shí)，真正能正確評(píng)價(jià)受試者體內(nèi)VitD貯存的指標(biāo)是生物可利用VitD，即AVitD。本研究可見，當(dāng)不考慮VitD2的生物效力時(shí)，許多受試者尚表現(xiàn)為有足夠的VitD貯存，但若將各種VitD組分折算為AVitD后，2/3以上疾病患者體內(nèi)VitD貯存不足或缺乏。

25(OH)D能被25-羥基維生素D3-3-差示酶作用，使VitD3第3個(gè)碳原子上的羥基空間位置由3β反轉(zhuǎn)為3α，形成3-epimer-25(OH)D3[14]，即C3-epi。C3-epi與VitD3有著相同分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)式,僅空間構(gòu)象不同，但它沒有生物活性[14]。因此，相同VitD3水平，如果C3-epi含量高，其實(shí)質(zhì)就是降低了VitD的體內(nèi)貯存。在兒童，尤其1歲以下嬰兒，由于VitD代謝通路尚不成熟，C-3異構(gòu)化可能是25(OH)D的主要代謝途徑之一，所以1歲以下嬰兒C3-epi濃度很高[15]。本組健康受試者的分析結(jié)果也能進(jìn)一步證明該結(jié)論。因此，兒童尤其是1歲以下嬰兒如果不檢測(cè)C3-epi水平，高估其體內(nèi)VitD貯存的可能性極大。隨著年齡的增長(zhǎng)，如果血清C3-epi濃度依然高，可能表明VitD代謝通路成熟較慢。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)處于疾病狀態(tài)時(shí)，患者C3-epi中位數(shù)和區(qū)間估計(jì)均高于健康受試者，表明某些疾病可能影響了機(jī)體內(nèi)VitD的正常代謝，從而影響了機(jī)體的真實(shí)VitD貯存水平，這類患者如果不檢測(cè)C3-epi水平，必將高估體內(nèi)VitD貯存。此外同VitD3一樣，VitD2也存在差向異構(gòu)化，但因?yàn)檎Ｉ頎顩r下甚至在多數(shù)疾病狀況下，VitD2在人體內(nèi)的含量遠(yuǎn)較VitD3低，因此，除研究外，臨床上檢測(cè)VitD2的差向異構(gòu)體對(duì)評(píng)價(jià)VitD貯存的意義不大。這也是本文不分析VitD2差向異構(gòu)體的原因。但是，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C3-epi增加的患者，有VitD2增加的趨勢(shì)。那么，C3-epi的生成與VitD2水平有無(wú)關(guān)系？是VitD2促進(jìn)C3-epi的生成，還是C3-epi增加導(dǎo)致的VitD2適應(yīng)性增加？VitD2增加是否也意味著其差向異構(gòu)體增加？這需要作進(jìn)一步研究。

目前，還沒有任何醫(yī)療機(jī)構(gòu)或研究單位提供VitD2、VitD3及其比值(VitD2/VitD3)的參考值范圍，因?yàn)楝F(xiàn)有臨床醫(yī)生均僅依據(jù)25(OH)D水平來(lái)評(píng)價(jià)受試者機(jī)體內(nèi)VitD貯存。分析原因：第一，現(xiàn)有臨床實(shí)驗(yàn)室所使用的免疫學(xué)檢測(cè)方法尚不能分別檢測(cè)VitD2和VitD3水平；第二，大多數(shù)人認(rèn)為機(jī)體內(nèi)VitD2水平遠(yuǎn)低于VitD3水平，VitD2的改變對(duì)總的25(OH)D水平影響不大；第三，極少有人關(guān)注C3-epi對(duì)25(OH)D水平的影響。但是，由于VitD2和VitD3活性不同，以及C3-epi形式的存在，即便相同25(OH)D檢測(cè)水平，也可能由于VitD2、VitD3和C3-epi的組成不同，從而表現(xiàn)出不同的VitD貯存水平。因此，想要準(zhǔn)確評(píng)估受試者機(jī)體內(nèi)VitD營(yíng)養(yǎng)狀況，就必須準(zhǔn)確測(cè)定VitD2、VitD3和C3-epi在內(nèi)的VitD組分。由此可見，正確選擇VitD的檢測(cè)方法和其必須的組分檢測(cè)，對(duì)正確認(rèn)識(shí)和評(píng)估受試者機(jī)體內(nèi)貯存至關(guān)重要。

由于受試者體內(nèi)VitD可能存在C3-epi形式，如果只是檢測(cè)血清25(OH)D水平，或者只檢測(cè)VitD2和VitD3水平均會(huì)過(guò)高估計(jì)受試者體內(nèi)VitD貯存。因此，C3-epi水平檢測(cè)對(duì)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)受試者體內(nèi)VitD貯存極為重要，尤其是1歲以下嬰兒和某些疾病患兒。