環狀RNA circMICRA在冠心病患者外周血中的差異性表達*

張 帥，劉志堅，馮倚帆，宋子威，李世寶,2△

1.徐州醫科大學附屬醫院檢驗科，江蘇徐州 221002；2.徐州醫科大學醫學技術學院，江蘇徐州 221002

冠心病(CAD)是最常見的心血管疾病，其發病率逐年增高并有年輕化的趨勢。心血管疾病死亡率位居世界疾病譜首位，約占全球總死亡人數的31%[1]。隨著人口老齡化和CAD風險因素負擔的日益增加，預計到 2030年世界范圍內每年將有超過2 000萬人死于急性心肌梗死、卒中及其他心血管疾病[2]。依據《中國心血管健康與疾病報告2019》，現患心血管疾病人數約有3.3億人，其中CAD患者就有1 100萬，而且自2005年開始，急性心肌梗死病死率呈快速上升趨勢。環狀RNA呈閉合環狀結構，具有高度穩定性、組織器官表達特異度、廣泛分布性，可在基因轉錄和表達等多層面發揮調節作用，已成為疾病的新型生物學標志及潛在的調控靶點[3]。本研究檢測并比較了心肌梗死相關環狀RNA(circMICRA、circCDR1AS、circZNF292)在CAD患者和健康人群中的表達改變，探究其在冠心病病理過程中可能發揮的作用，以期為CAD的防治提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年10月至2019年11月期間在徐州醫科大學附屬醫院(下稱本院)就診的男性CAD患者58例作為CAD組，平均年齡(57.1±3.7)歲。選擇同期在本院進行健康體檢的47例男性體檢健康者作為對照組，平均年齡(57.3±3.1)歲。CAD組的納入標準：冠狀動脈主要血管及其分支狹窄超過50%。排除標準：(1)心源性疾病，如先天性心臟病、心臟瓣膜病、急性心力衰竭等；(2)系統性疾病，如惡性腫瘤、自身免疫性疾病、嚴重肝腎疾病等。對照組為同期進行健康體檢的無CAD疾病者，排除標準與CAD組相同。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有研究對象對本研究內容知情并簽署知情同意書。

1.2標本及臨床資料收集 收集所有研究對象的2 mL乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血，按1∶3的比例加入紅細胞裂解液，充分裂解后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清液，加入1 mL Trizol試劑，-80 ℃條件下保存備用。收集以下臨床資料：年齡、性別、身高、體質量、體質量指數(BMI)、血壓、空腹血糖水平(FPG)、血脂水平、吸煙史(有/無)、飲酒史(有/無)、原發性高血壓史(有/無)、糖尿病史(有/無)、高脂血癥病史(有/無)、冠狀動脈造影報告以及血常規結果(中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、血小板)計數等。

1.3冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度評估 采用Gensini得分評估冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度。Gensini評分主要包括兩方面：(1)對冠狀動脈狹窄的程度進行評分，狹窄小于25%為1分；25%～<50%為2分；50%～<75%為4分；75%～<90%為8分；90%～<100%為16分；100%為32分；(2)Gensini評分系統把冠狀動脈分為15節段，根據冠狀動脈不同節段的供血區域及生理意義，賦予冠狀動脈各節段不同的權重系數。各節段評分與對應系數乘積累積求和即為最終的Gensini得分。

1.4系統性炎癥標志物計算 收集外周血血常規結果，根據中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞和血小板計數，計算系統性炎癥指標：中性粒細胞與淋巴細胞比值(NLR)、血小板與淋巴細胞比值(PLR)以及單核細胞與淋巴細胞比值(MLR)。

1.5總RNA提取及逆轉錄 采用Trizol試劑進行外周血總RNA提取。Thermo Nanodrop 2000C分光光度計檢測RNA純度，理想純度為A260/A280比值為1.8～2.0，A260/A230比值為2.0～2.2。本實驗采用TOYOBO公司ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover試劑盒進行RNA逆轉錄反應。逆轉錄合成的cDNA置于-80 ℃條件下保存備用。

1.6實時定量PCR(qPCR)檢測 qPCR所采用的的引物由Primer premier 5.0軟件設計，選用GAPDH基因為內參基因。引物序列信息見表1。qPCR選用20 μL反應體系，包括SYBR Green Mix 10.0 μL、10 μmol/L上游引物1.0 μL、10 μmol/L下游引物1.0 μL、cDNA模板1.0 μL、ddH2O 7.0 μL。反應條件為95 ℃預變性5 min,95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環40次。每個cDNA樣本均設置兩個副孔。采用2-ΔΔCt法計算相對表達水平。

表1 引物序列及產物長度

2 結 果

2.1研究人群的基本特征 如表2所示，CAD組和對照組均為男性，兩組年齡差異無統計學意義[(57.1±3.7)歲vs.(57.3±3.1)歲，P=0.803]。與對照組相比，CAD組具有較高的BMI水平、飲酒率、高血壓患病率、糖尿病患病率和高脂血癥患病率，但差異均無統計學意義(P>0.05)，吸煙率在兩組間差異有統計學意義(P<0.001)。

表2 研究人群臨床特征比較

2.2circMICRA與CAD風險因素的相關性 將CAD組和對照組合并后進行Spearman相關分析，結果顯示circMICRA表達水平與吸煙(r=-0.335，P<0.001)和高血壓(r=-0.371，P<0.001)呈負相關。線性回歸模型在校正年齡、BMI水平、吸煙、飲酒、糖尿病和高脂血癥等因素后，circMICRA表達水平仍與高血壓呈負相關(β=-0.337，P=0.001)。以納入對象的年齡和BMI的平均值為界值以及是否具有吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病和高脂血癥相關病史，將所有研究對象按上述臨床參數的不同各分為兩組，經t檢驗分析，circMICRA表達水平在組間的差異，分析結果進一步證實了circMICRA表達水平與吸煙、高血壓因素相關(P<0.05)，見表3。

表3 circMICRA在亞組中的表達差異

2.3circMICRA在CAD組中表達降低 circMICRA表達水平經對數轉化后符合正態分布。與對照組相比，circMICRA表達水平在CAD組中顯著降低(-0.346±0.327vs.-0.125±0.197，P<0.001)，見圖1A。使用Logistic回歸進一步分析circMICRA在冠心病中的作用，結果顯示在校正年齡、BMI、吸煙率、飲酒率、高血壓患病率、糖尿病患病率和高脂血癥患病率后，circMICRA表達能降低CAD發病風險(OR=0.031，95%CI：0.004～0.251，P=0.001)。環狀RNA circCDR1AS表達水平(-0.505±0.421vs.-0.374±0.278，P=0.061)和circZNF292表達水平(-0.093±0.399vs.-0.114±0.205，P=0.731)在CAD組和對照組間差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1A。

圖1 circMICRA在CAD組、對照組、低Gensini組和高Gensini組的表達水平

2.4circMICRA表達水平與冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度的關系 Spearman相關分析顯示，circMICRA表達水平與Gensini得分呈負相關(r=-0.391，P=0.002)，見圖2A。以Gensini得分的中位數為界值，把CAD患者分為兩組：高Gensini得分組(>71.5)和低Gensini得分組(≤71.5)。t檢驗分析顯示，高Gensini得分組的circMICRA表達水平顯著低于低Gensini得分組，差異有統計學意義(-0.488±0.317vs.-0.239±0.296，P=0.003)，進一步揭示了circMICRA表達水平與冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度有關，見圖1B。

2.5circMICRA表達水平與炎癥指數的關系 依據外周血血常規檢查結果計算CAD患者的炎癥指數：NLR、PLR及MLR。Spearman相關分析顯示，circMICRA表達水平與NLR(r=-0.367,P=0.005)和PLR(r=-0.403,P=0.002)呈負相關，提示circMICRA可能作為炎癥相關因子參與CAD過程。circMICRA表達水平與MLR不相關(r=-0.165,P=0.215)，見圖2B和2C。

圖2 circMICRA表達水平與Gensini得分、NLR和PLR的相關性

3 討 論

隨著居民生活水平的提高，不健康生活方式的流行和社會老齡化，我國居民動脈粥樣硬化性心血管病(ASCVD)呈現低齡化、快速增長趨勢。目前，ASCVD位居我國死亡原因的首位，占居民疾病死亡構成比的40%以上[4]?！吨袊l生和計劃生育統計年鑒》統計結果顯示，2012年以來，中國居民CAD死亡率有持續上升趨勢。CAD是遺傳因素與環境因素共同作用下的復雜性疾病，其中遺傳因素是引發CAD的主要因素之一。鑒定CAD的遺傳因素并研究其在疾病發生發展中的作用，對CAD的防治具有重大意義。

越來越多的研究顯示，環狀RNA與心血管疾病的發生密切相關，第一個被發現與心血管疾病相關的環狀RNA是心臟相關環狀RNA circHRCR，其通過抑制miRNA-223活性可減緩心肌肥厚和心力衰竭的發展[5]。小鼠心肌梗死模型研究發現，環狀RNA circCDR1AS的過表達能夠加重心肌細胞凋亡程度，加大心肌梗死面積[6]。SONG等[7]還發現，circANRIL表達下調顯著降低TC、TG、LDL等血脂水平以及C-反應蛋白(CRP)、白細胞介素-1(IL-1)、IL-6等炎癥因子的表達，減緩血管內皮細胞凋亡，發揮抗動脈粥樣硬化的作用。心肌細胞系研究顯示，環狀RNA circZNF292靶向作用于BNIP3基因，可減緩缺氧性心肌損傷，環狀RNA circZNF292調節內皮細胞和心肌細胞增殖和凋亡，影響血管內皮細胞生理功能，進而參與心血管疾病的發展[8-9]。

circMICRA(hsa_circ_0000615)為心肌梗死相關環狀RNA由位于人類基因組chr15:64791491-64792365的鋅指蛋白609(ZNF609)基因的外顯子反向剪接而成。本研究發現，與對照組相比，circMICRA表達水平在CAD組中顯著降低，差異有統計學意義(-0.346±0.327vs.-0.125±0.197，P<0.001)。Logistic回歸的進一步分析顯示，在校正年齡、BMI、吸煙率、飲酒率、高血壓患病率、糖尿病患病率和高脂血癥患病率后，circMICRA表達能降低CAD發病風險(OR=0.031，95%CI：0.004～0.251，P=0.001)。本研究也揭示了circMICRA表達水平與冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度呈負相關，即高Gensini得分組的circMICRA表達水平顯著低于低Gensini得分組。ANTONIO等[10]研究發現，環狀RNA circMICRA表達水平在嚴重心肌梗死患者外周血中顯著降低，與本研究結果一致。LIU等[11]研究發現，circMICRA在CAD患者外周血中表達下調，進而通過糖尿病血管內皮細胞實驗證實，circMICRA與 miR-615-5p相互作用影響血管內皮細胞遷移和凋亡，導致血管內皮功能紊亂，進而參與動脈粥樣硬化的發展。有研究發現，circMICRA能夠競爭性結合miR-145-5p，可通過調控miR-145-5p下游靶基因ABCA1和SMAD3的表達而促進血管平滑肌細胞的增殖、遷移和凋亡[12-13]。經starBase數據庫預測，circMICRA與miR-150-5p有結合位點，細胞系實驗進一步證實miR-150-5p是circMICRA的直接靶標[14]。而miR-150能促進內皮細胞增殖和遷移，抑制心肌梗死后血管重構，進而參與CAD的發展[15]。此外，circMICRA還具有轉錄翻譯成蛋白質的功能，并在肌細胞增殖過程中發揮重要作用[16]。綜上所述，環狀RNA circMICRA可通過調節多種miRNAs及其下游靶基因的表達參與CAD的發生發展。

Spearman相關分析顯示，circMICRA表達水平與高血壓呈負相關。線性回歸模型校正年齡、BMI、吸煙率、飲酒率、糖尿病患病率和高脂血癥患病率后，circMICRA表達水平仍與高血壓患病率呈負相關。LIU等[11]研究也發現，與健康對照者相比，高血壓患者外周血中circMICRA表達水平顯著降低，而miR-615-5p表達水平上調。高血壓會導致內皮細胞損傷和凋亡，是CAD的傳統危險因素。環狀RNA circMICRA表達下調可能是高血壓的一種代償性反應，能保護內皮細胞免受壓力，有助于缺血性疾病的血管再生。本研究發現，circMICRA表達水平與系統性炎癥指數NLR和PLR也呈負相關，提示circMICRA可能作為炎癥相關因子參與動脈粥樣硬化的發生、發展過程。LIANG等[17]研究也發現，circMICRA表達水平與MLR、NLR和PLR呈負相關，與本研究結果一致。MLR和NLR是心血管疾病的獨立預測因素，而且與冠狀動脈損傷的程度和嚴重程度呈正相關[18]。PLR增高是慢性炎癥的標志，也是CAD發生的危險因素[19]。據報道，NLR和PLR與炎癥指標IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和C反應蛋白(CRP)呈正相關，而circMICRA表達水平與這些炎癥指標呈負相關，即circMICRA表達能降低促炎因子(IL-6、TNF-α)表達，增加抗炎因子(IL-10)表達，表明circMICRA在CAD炎性反應中起保護作用[17]。circMICRA還可通過抑制miR-22-3p活性，調節IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子蛋白水平，進而影響CAD的病理過程[20]。Spearman相關分析顯示，circMICRA表達水平與吸煙呈負相關。在校正年齡、BMI水平、飲酒率、高血壓患病率、糖尿病患病率和高脂血癥患病率后，circMICRA表達水平與吸煙則無相關性。這可能是由于納入的樣本量過少導致的基本資料偏倚。但是在校正吸煙率前后，circMICRA表達均能降低CAD發病風險，說明吸煙率差異并沒有影響本研究的結果。

血糖、血脂、血壓受生理性因素和藥物因素等影響較大，不能反映機體真實的代謝水平，所以本文選用是否具有相關病史作為分析校正因素，有待進一步研究證明。本研究仍有不足之處：(1)研究人群樣本量太少，需要增加樣本量來驗證本研究得出的結果。(2)由于樣本的限制，本文并未檢測冠狀動脈粥樣斑塊中circMICRA表達水平。(3)因最終符合納入標準并具有完整臨床資料的女性CAD患者較少，本文納入的全是男性CAD患者，可能存在性別偏倚。

綜上所述，circMICRA表達水平在CAD患者外周血中顯著降低，而且與冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度呈負相關，可能作為一種保護性因素通過炎癥途徑參與CAD的病理過程。