G蛋白信號轉導調節因子19在結腸癌中的表達及臨床意義*

謝平凡,譚 林,周紅兵,陳維順

中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院消化內科，湖南株洲 412000

結腸癌是全球常見的惡性腫瘤之一，其死亡率位居所有腫瘤的第二位[1]。結腸癌患者早期臨床癥狀不明顯，大多數患者確診時已是中晚期，已錯過早期診斷及治療的最佳時機。準確的早期診斷是治療結腸癌的關鍵。G蛋白信號調節蛋白(RGS)家族是一類能負性調節G蛋白活性的多功能蛋白。RGS19，是第一個被發現的RGS家族成員，參與調節G蛋白偶聯受體(GPCR)下游細胞信號活動并與細胞增殖和生長密切相關[2]。RGS19蛋白的轉錄水平改變與多種癌癥的發生和發展有關。在卵巢癌[2]、胃癌[3]、前列腺癌[4]等癌細胞中均發現RGS19表達上調，進而促進癌細胞增殖。目前，RGS19在結腸癌中表達情況和作用的相關報道甚少。為了明確RGS19在結腸癌中的表達水平及其臨床意義，本文比較了RGS19在結腸癌組織和癌旁組織中的表達，并進一步分析了RGS19在結腸癌中的表達與臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2014年5月至2015年7月結腸癌根治手術切除的100例結腸癌及30例癌旁組織標本。癌旁組織距癌組織邊緣>15 cm，病理證實無癌浸潤。所有標本來源的病例均經病理學診斷為原發性腺癌，且術前均未接受放化療及相關靶向藥物治療。根據美國聯合癌癥委員會第八版TNM分類[5]對這些病例進行TNM分期，根據病理標準確認分化程度(高、中、低)。本研究組織標本的獲取及使用均經本院倫理委員會批準，所有患者對本研究均知情。通過電話對所有患者進行隨訪，以手術日期為起始時間，以死亡為終點時間，隨訪截止時間為2020年7月。共隨訪100例，失訪0例。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色 結腸癌組織及癌旁組織經石蠟包埋處理后，切片為4 μm厚度。切片經二甲苯脫蠟處理，梯度乙醇(100.0%、85.0%、75.0%、50.0%乙醇)及雙蒸水浸泡水化處理。用3.0%過氧化氫消除內源性過氧化物酶活性，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗。水浴鍋加熱枸櫞酸鈉緩沖液(0.01 mol/L，pH 6.0)至90 ℃恒溫，浸入切片繼續加熱15～30 min進行抗原修復，隨后自然冷卻。切片經PBS清洗后用10.0%兔血清37 ℃封閉10～15 min。棄去封閉液，加入RGS19一抗(稀釋比例1∶1 200)，4 ℃孵育過夜。次日將切片用PBS清洗后滴加生物素標記的二抗工作液，37 ℃孵育20 min；PBS清洗，切片滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37 ℃孵育20 min。PBS洗滌后進行DAB顯色反應，以及蘇木精復染細胞核。脫水和封片后置于顯微鏡下觀察，每個切片中隨機選擇5個視野進行結果統計。

1.2.2結果判斷 RGS19的免疫組織化學結果由兩位獨立研究人員進行評估。RGS19染色定位于細胞核內。按陽性細胞百分比計分：0.0%～5.0%為0分，>5.0%～25.0%為1分，>25.0%～50.0%為2分，>50.0%～75.0%為3分，>75.0%～100.0%為4分；按染色強度計分：無染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分。根據上述兩項得分的乘積來劃分低表達組和高表達組：<6分為低表達，≥6分為高表達。

1.3統計學處理 采用SPSS26.0軟件進行統計學分析，計量資料用n表示，采用χ2檢驗分析RGS19在結腸癌及癌旁組織中的表達差異及與臨床病理參數的關系；生存分析采用Kaplan-Meier生存曲線分析法，并用Log-rank檢驗其統計意義；Cox回歸模型分析結腸癌預后影響因素。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1RGS19在結腸癌組織中表達較癌旁組織高 免疫組化結果顯示RGS19蛋白陽性染色定位于細胞核內。統計結果顯示在30例癌旁組織中，RGS19的高表達率為33.3%；而在100例結腸癌組織中，RGS19的高表達率為61.0%，高于癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1和圖1。

注：A為癌旁組織低表達；B為結腸癌組織低表達；C為結腸癌組織高表達。

表1 RGS19在結腸癌組織和癌旁組織中的表達[n(%)]

2.2RGS19的表達與臨床病理特征的關系 RGS19在結腸癌組織中的表達與患者N分期、M分期和TNM分期有關(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度和T分期無關(P>0.05)，見表2。

表2 結腸癌中RGS19的表達與臨床病理特征的關系(n)

2.3RGS19高表達和低表達結腸癌患者5年生存分析 對本研究100例結腸癌患者隨訪5年，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，RGS19低表達的患者中位生存時間為52個月，高于RGS19高表達患者的38個月，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3；RGS19低表達的患者總生存率(76.9%)高于RGS19高表達患者總生存率(44.3%)，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

表3 RGS19表達與結腸癌患者5年生存時間的關系

圖2 RGS19高表達和低表達結腸癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4結腸癌患者預后的影響因素分析 單因素Cox回歸分析顯示結腸癌RGS19的表達與TNM分期、T分期、N分期一樣，都是影響結腸癌患者預后的因素；多因素Cox回歸分析顯示RGS19表達水平和TNM分期是影響結腸癌患者預后的獨立因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響結腸癌患者預后的單因素及多因素分析

3 討 論

結腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤。隨著結腸癌篩查的廣泛開展，作為篩查目標人群的老年人中結腸癌的死亡率有所下降，但50歲以下的人群中結腸癌的發病率和死亡率卻一直在增加[6]。結腸癌的診斷主要依靠臨床表現和輔助檢查。早期結腸癌患者癥狀不明顯或輕微，是導致結腸癌不能被早發現和早治療的主要原因。本研究通過檢測結腸癌和癌旁組織RGS19的表達，并分析其與結腸癌患者臨床病理特征和預后的關系，旨在為結腸癌診斷提供新的腫瘤標志物。

GPCR介導的信號傳導通路在調節細胞穩態及應激響應中起著重要作用[7]。GPCR通過與G蛋白偶聯來調節細胞內相關酶活性，產生第二信使作用于下游效應蛋白，從而將配體信號由細胞外傳遞至細胞內，改變細胞功能活性。G蛋白由α、β和γ 3個亞基組成。Gα亞基與GDP結合，以無活性狀態存在；當GPCR與配體結合而激活后，Gα與β和γ亞基解離，并與GDP分離而與GTP結合。與GTP結合的Gα亞基處于活性狀態，參與下游信號傳導途徑。RGS是一類GTP酶激活蛋白，可激活Gα亞基內在的GTP酶，使得與Gα亞基結合的GTP水解為GDP，使Gα亞基失活，從而負調節GPCR介導的信號通路[7]。RGS家族蛋白擁有130個氨基酸的保守結構域及結合激活的Gα亞基[8]。迄今為止，有研究發現RGS蛋白調節G蛋白信號轉導通路參與多種細胞生物過程，包括細胞增殖、分化、質膜運輸、細胞運動和胚胎發育等[9]。目前RGS家族已被發現有20多位成員[10]，其中至少有14種RGS蛋白被證明參與多種癌癥的發生和發展進程[11]，其中研究較多的是RGS17、RGS20。RGS19在腫瘤中的作用也廣泛受到關注，但目前相關研究結論不一。SAKAGUCHI等[12]通過GEO數據庫、Oncomine數據庫和TCGA數據庫分析了RGS19在不同腫瘤和正常組織中的基因和蛋白表達水平，結果顯示RGS19在膀胱癌、乳腺癌和腎癌組織中的表達均高于正常組織[3]。同樣在其他臨床研究中發現卵巢癌[2]、胃癌[3]、胰腺癌[13]、肺癌[14]中均有RGS19蛋白表達增加。然而，另外一些研究報道RGS19在白血病、肺癌和淋巴瘤中的表達低于正常組織[3]。在本研究中，RGS19在結腸癌組織中的高表達率(61.0%)明顯高于癌旁組織(33.3%)，這與肺癌[13]、卵巢癌[15]中的研究結論一致。研究發現在小鼠F9畸胎瘤細胞中，低表達的RGS19會抑制Wnt/β-catenin信號傳導[16]。Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與結腸癌腫瘤細胞的過度增殖和惡變有關,參與結/直腸癌的發生；而阻斷Wnt/β-catenin通路可抑制腫瘤的生長[17]。另外，JI等[18]研究發現上調RGS19可增加畸胎瘤細胞Akt的磷酸化水平，上調細胞周期蛋白D1/3，從而促進腫瘤細胞增殖。這些研究提示，RGS19能通過多重機制調控腫瘤細胞的增殖，參與腫瘤的發生和發展[2]。

在本研究中，RGS19高表達的結腸癌患者與RGS19低表達的患者相比，總生存時間明顯縮短，總生存率降低。RGS19表達是結腸癌患者預后不良的獨立危險因素。SAKAGUCHI等[12]在關于舒尼替尼耐藥的腎透明細胞癌的研究中也有相似的發現，即RGS19高表達患者的總生存時間及無復發生存時間均低于低表達患者，并通過Cox分析發現RGS19是腎透明細胞癌的獨立危險因子。眾所周知，影響結腸癌預后的因素包括腫瘤的快速增殖和腫瘤的侵襲、轉移。本研究結果顯示結腸癌中高表達RGS19與淋巴結轉移、遠處轉移和TNM分期有關，RGS19高表達者遠處轉移早，生存時間短，預后差。因此，檢測RGS19的表達水平對判定結腸癌的侵襲轉移與預后有一定臨床價值。RGS19促進腫瘤侵襲轉移的機制尚未明確。WANG等[19]研究發現，RGS19能結合GIPC蛋白，激活PI3K/Akt通路。該通路是介導細胞增殖、存活和遷移的常見信號通路；同時Akt磷酸化使MDM2從細胞質轉移到細胞核，可使p53核失活，可進一步增強腫瘤細胞的侵襲轉移能力[20]。本研究推測在結腸癌中RGS19可能有相似的作用機制。以上研究提示，RGS19在結腸癌中上調可能參與了結腸癌的發生和轉移，可成為結腸癌預后判定的潛在指標，有必要就其具體機制，從分子水平、細胞水平和臨床水平進行多層面的研究。

綜上所述，RGS19在結腸癌患者中呈高表達，是影響患者預后的獨立因素，可作為結腸癌診斷、預后判斷的標志物以及治療的新靶點[20]。