血清白細(xì)胞介素-35、T 細(xì)胞亞群與膿毒癥病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系

金 磊 朱佳佳 楊亞東

1.長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北荊州 434023；2.安徽省淮南市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，安徽淮南 232000；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院影像醫(yī)學(xué)科，安徽合肥 230031

膿毒癥是機(jī)體對(duì)嚴(yán)重?zé)齻?chuàng)傷、感染等原因引起的炎癥反應(yīng)失調(diào)所致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，具有發(fā)病率高、病情進(jìn)展迅速、病死率高、預(yù)后差等特點(diǎn)[1-3]。研究顯示[4-5]，炎癥反應(yīng)及免疫功能紊亂在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。白細(xì)胞介素-35（interleukin-35，IL-35）是由調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞合成并分泌的免疫抑制細(xì)胞因子，通過抑制Th17 細(xì)胞分化及效應(yīng)T 細(xì)胞增殖等參與機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，IL-35 的異常改變介導(dǎo)了支氣管哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病發(fā)病過程[6-7]。T 細(xì)胞亞群是構(gòu)成人體細(xì)胞免疫、免疫逃逸及全身炎癥反應(yīng)的重要部分，在維持免疫穩(wěn)態(tài)及免疫應(yīng)答終止方面發(fā)揮作用，T 細(xì)胞亞群異常表達(dá)可反映免疫性疾病病情嚴(yán)重性及預(yù)后[8]。因此，本研究檢測(cè)血清IL-35 和T 細(xì)胞亞群，旨在探討其與膿毒癥病情嚴(yán)重性及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集安徽省淮南市第一人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）2019 年7 月至2020 年7 月收治的240 例膿毒癥患者為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①典型臨床癥狀如寒戰(zhàn)、高熱或低體溫、意識(shí)障礙等，經(jīng)血常規(guī)、病原菌、實(shí)驗(yàn)室感染指標(biāo)等檢查診斷為膿毒癥，符合《中國嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南（2014）》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡18～80 歲；③發(fā)病至進(jìn)入重癥監(jiān)護(hù)治療病房（intensive care unit，ICU）時(shí)間＜24 h；④臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①進(jìn)入ICU 前接受過免疫抑制劑治療；②急、慢性炎癥反應(yīng)疾病；③合并有其他自身免疫性疾病；④病情危重，預(yù)計(jì)生存時(shí)間＜7 d；⑤慢性器官功能衰竭或血液系統(tǒng)疾病；⑥惡性腫瘤；⑦精神疾病。病例組男151 例，女89 例；年齡（56.17±6.28）歲；體重指數(shù)（22.59±2.04）kg/m2。另選60 名于我院同期體檢健康者為對(duì)照組，對(duì)照組無基礎(chǔ)疾病，近期未服用任何治療藥物，其中男33 名，女27 名；年齡（54.89±6.32）歲；平均體重指數(shù)（23.05±1.93）kg/m2。兩組性別、年齡、體重指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

根據(jù)2016 年美國重癥醫(yī)學(xué)會(huì)與歐洲重癥醫(yī)學(xué)會(huì)膿毒癥定義及診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]將病例組分為膿毒癥組（71 例）、嚴(yán)重膿毒癥組（126 例）、膿毒性休克組（43 例）。根據(jù)病例組入ICU 后28 d 的預(yù)后情況將其分為存活組（182 例）、死亡組（58 例）。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 血清IL-35、T 細(xì)胞亞群檢測(cè) 收集病例組入ICU 后次日清晨肘正中靜脈血5 ml，對(duì)照組于體檢當(dāng)日抽取，血液標(biāo)本置于含乙二胺四乙酸的抗凝試管中于室溫下靜置1 h，將血液標(biāo)本分為2 份，其中一份以3000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心5 min，離心半徑12 cm，留取上清液置于-80℃環(huán)境下保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清IL-35，檢測(cè)儀器為羅氏c6000 全自動(dòng)免疫分析儀（美國貝克曼庫爾特），試劑盒由Abnova提供（生產(chǎn)批號(hào)：KA1143）。另一份血液標(biāo)本分離采用BD FACS Canto plus 流式細(xì)胞儀（美國BD 公司）檢測(cè)T 細(xì)胞亞群，包括CD3+、CD4+、CD8+，并計(jì)算CD4+/CD8+比值。檢測(cè)過程嚴(yán)格按照試劑盒上說明進(jìn)行。

1.2.2 膿毒癥相關(guān)量表評(píng)估 采用急性生理學(xué)和慢性健康狀況評(píng)價(jià)Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ）[11]對(duì)患者進(jìn)行評(píng)定，總分71 分，分?jǐn)?shù)越高則膿毒癥患者病情越嚴(yán)重。采用膿毒癥相關(guān)性器官功能衰竭評(píng)價(jià)（sepsis-related organ failure assessment，SOFA）[12]對(duì)患者的呼吸、凝血、肝、循環(huán)、神經(jīng)和腎臟等器官進(jìn)行評(píng)估，總分48 分，分?jǐn)?shù)越高提示患者預(yù)后越差。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 9.4 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性。采用受試者操作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC 曲線）及其曲線下面積（area under curve，AUC）分析血清IL-35、CD4+/CD8+對(duì)膿毒癥患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對(duì)照組血清IL-35、T 細(xì)胞亞群水平比較

病例組血清IL-35、CD8+水平高于對(duì)照組，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 病例組與對(duì)照組血清IL-35、T 細(xì)胞亞群水平比較（）

表1 病例組與對(duì)照組血清IL-35、T 細(xì)胞亞群水平比較（）

注：IL-35：白細(xì)胞介素-35

2.2 不同嚴(yán)重程度膿毒癥患者血清IL-35、T 細(xì)胞亞群水平及APACHEⅡ比較

嚴(yán)重膿毒癥組、膿毒性休克組血清IL-35、CD8+水平及APACHEⅡ得分均高于膿毒癥組，且膿毒性休克組高于嚴(yán)重膿毒癥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。嚴(yán)重膿毒癥組、膿毒性休克組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均低于膿毒癥組，且膿毒性休克組低于嚴(yán)重膿毒癥組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表2。

表2 不同嚴(yán)重程度膿毒癥患者血清IL-35、T 細(xì)胞亞群水平及APACHEⅡ比較（）

表2 不同嚴(yán)重程度膿毒癥患者血清IL-35、T 細(xì)胞亞群水平及APACHEⅡ比較（）

注：與膿毒癥組比較，aP ＜0.05；與嚴(yán)重膿毒癥組比較，bP ＜0.05。IL-35：白細(xì)胞介素-35；APACHEⅡ：急性生理學(xué)和慢性健康狀況評(píng)價(jià)Ⅱ

2.3 不同預(yù)后膿毒癥患者血清IL-35、T 細(xì)胞亞群水平及SOFA 比較

存活組血清IL-35、CD8+水平及SOFA 得分均低于死亡組，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均高于死亡組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表3。

表3 不同預(yù)后膿毒癥患者血清IL-35、T 細(xì)胞亞群水平及SOFA 比較（）

表3 不同預(yù)后膿毒癥患者血清IL-35、T 細(xì)胞亞群水平及SOFA 比較（）

注：IL-35：白細(xì)胞介素-35；SOFA：膿毒癥相關(guān)性器官功能衰竭評(píng)價(jià)

2.4 血清IL-35、T 細(xì)胞亞群與APACHEⅡ、SOFA 得分的相關(guān)性

病例組IL-35、CD8+與APACHEⅡ、SOFA 得分均呈正相關(guān)（r ＞0，P ＜0.05），CD3+、CD4+、CD4+/CD8+與APACHEⅡ、SOFA 得分均呈負(fù)相關(guān)（r ＜0，P ＜0.05）。見表4。

表4 血清IL-35、T 細(xì)胞亞群與APACHEⅡ、SOFA 得分的相關(guān)性

2.5 血清IL-35、CD4+/CD8+對(duì)膿毒癥患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC 曲線結(jié)果顯示，血清IL-35 預(yù)測(cè)膿毒癥患者治療28 d 后死亡的AUC 為0.827（95%CI：0.776～0.880），靈敏度、特異性分別為81.03%、84.07%，約登指數(shù)為0.65，截?cái)嘀禐?.47 ng/L；CD4+/CD8+預(yù)測(cè)膿毒癥患者治療28 d 后死亡的AUC 為0.849（95%CI：0.800～0.898），靈敏度、特異性分別為84.48%、88.46%，約登指數(shù)為0.73，截?cái)嘀禐?.95；IL-35 聯(lián)合CD4+/CD8+預(yù)測(cè)死亡的AUC 為0.923（95%CI：0.892～0.954），靈敏度、特異性分別為91.38%、95.05%，約登指數(shù)為0.86。見圖1。

圖1 血清IL-35、CD4+/CD8+預(yù)測(cè)膿毒癥患者預(yù)后的受試者操作特征曲線

3 討論

全球每年新增膿毒癥患者超過3150 萬例，其中近530 萬例患者死亡[13]，據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心報(bào)道[14]，我國每年因膿毒癥死亡的患者超過100 萬例。由感染、創(chuàng)傷等多種因素引起機(jī)體免疫功能失衡，同時(shí)病原微生物與巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞識(shí)別受體結(jié)合后導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子和趨化因子大量釋放，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步級(jí)聯(lián)放大，最終發(fā)生全身炎癥反應(yīng)綜合征[15]。因此，炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫功能紊亂是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的病理生理基礎(chǔ)。IL-35 是由Treg 細(xì)胞合成的免疫抑制細(xì)胞因子，在維持機(jī)體外周免疫耐受性及抑制效應(yīng)T 細(xì)胞增殖、Th17 細(xì)胞分化方面發(fā)揮功能[16-18]。IL-35 通過促進(jìn)IL-10 產(chǎn)生和抑制促炎性細(xì)胞因子γ 干擾素、IL-17 等在炎癥疾病中發(fā)揮抑制特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)和減輕炎癥反應(yīng)的作用[19-20]。IL-35 作為炎癥抑制因子參與了支氣管哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程，并與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)[21-23]。過度促炎反應(yīng)會(huì)加重機(jī)體免疫損傷，而過度抑炎反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，弱化機(jī)體殺傷或清除病原菌的能力[8]。T 細(xì)胞亞群在免疫應(yīng)答過程中具有重要作用，其中CD3+、CD4+協(xié)同體液免疫和細(xì)胞免疫發(fā)揮免疫功效，CD8+通過抑制和殺傷作用誘導(dǎo)并維持機(jī)體免疫耐受能力，CD4+/CD8+綜合反映機(jī)體免疫狀態(tài)，其水平降低提示免疫機(jī)能下降[24-25]。

本研究中，病例組較對(duì)照組血清IL-35 異常升高，可能是因?yàn)闄C(jī)體通過活化Treg 細(xì)胞而啟動(dòng)抗炎反應(yīng)以抑制膿毒癥發(fā)病過程中炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷，Treg 細(xì)胞釋放的IL-35 可上調(diào)誘導(dǎo)型Treg 的表達(dá)使機(jī)體對(duì)炎癥反應(yīng)的耐受性增強(qiáng)[5]。本研究還發(fā)現(xiàn)不同嚴(yán)重程度的膿毒癥患者T 細(xì)胞亞群異常程度不同，提示T 細(xì)胞亞群與膿毒癥患者免疫功能失衡密切相關(guān)，與有關(guān)研究結(jié)果一致[8,26]。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著膿毒癥病情加重，血清IL-35 水平逐漸升高，T 細(xì)胞亞群異常改變顯著，這與膿毒癥炎癥反應(yīng)越激烈其免疫抑制越明顯有關(guān)。APACHEⅡ評(píng)分作為反映膿毒癥病情的指標(biāo)，相關(guān)性分析顯示其與血清IL-35、CD8+呈正相關(guān)，與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)，提示IL-35、T 細(xì)胞亞群異常改變可反映膿毒癥病情嚴(yán)重性。此外，與死亡組比較，存活組血清IL-35 水平降低，T 細(xì)胞亞群異常改變更顯著。SOFA 得分與預(yù)后有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者SOFA 得分與血清IL-35、CD8+呈正相關(guān)，與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)，提示IL-35、T 細(xì)胞亞群對(duì)預(yù)測(cè)預(yù)后有重要意義。本研究選取CD4+/CD8+作為T 細(xì)胞亞群綜合指標(biāo)，通過繪制ROC 曲線評(píng)估IL-35、CD4+/CD8+對(duì)膿毒癥患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示，IL-35、CD4+/CD8+對(duì)膿毒癥患者治療28 d時(shí)死亡風(fēng)險(xiǎn)均有預(yù)測(cè)價(jià)值，并且聯(lián)合預(yù)測(cè)死亡風(fēng)險(xiǎn)的價(jià)值更高，提示聯(lián)合檢測(cè)IL-35 和T 細(xì)胞亞群可有效預(yù)測(cè)患者預(yù)后，從而為臨床早期制訂針對(duì)性干預(yù)措施提供參考。

綜上所述，血清IL-35、T 細(xì)胞亞群異常改變參與了膿毒癥發(fā)病過程，并且與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后有關(guān)，早期聯(lián)合檢測(cè)可作為判斷病情和預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)。本研究為單中心的回顧性研究，所得結(jié)論仍需要多中心前瞻性的臨床研究來證實(shí)。