幽門螺桿菌毒力因子CagA 對人正常胃上皮HFE145 細胞CDX1 表達及上皮間質轉化的影響

張珊珊 苗 豐 劉 露 呂文瑤 張 紳 趙志峰

1.中國醫科大學附屬第四醫院消化內科，遼寧沈陽 110032；2.中國醫科大學附屬第四醫院腫瘤科，遼寧沈陽 110032

細胞毒素相關基因A（cytotoxin related gene A，CagA），是幽門螺桿菌（Helicobacter pylor，Hp）的重要毒力因素之一，是Hp-CagA 致病島編碼的蛋白質。研究顯示，與CagA 陰性菌株比較，CagA 陽性菌株Hp感染胃癌風險明顯增加[1-4]。CagA 與腸化生發生關系密切，CagA 與E-cadherin 和β-catenin 信號通路相互作用可能是導致腸化生的重要因素，但CagA 促使胃上皮向腸樣上皮細胞轉化的機制尚未完全闡明[5-6]。尾型同源盒基因1（cadual type homeobox transcription factor 1，CDX1）是一種同源盒轉錄因子，是一種βcatenin 依賴性基因，由解除調控的β-catenin 反式激活，可由Hp-CagA 觸發，在人類腸道發育和功能維持中發揮重要作用[7-8]。對恒河猴的研究顯示，Hp 感染胃黏膜后，胃上皮細胞CDX1 表達增加1.59 倍，異常表達的CDX1 與Barrett 食管發育及腸化生、異型增生和胃癌發生密切相關[9]。既往研究顯示，穩定表達CagA 的胃癌細胞中CDX1 表達增加[10]。本研究觀察Hp 毒力因子CagA 是否增加人正常胃上皮HFE145細胞中CDX1 表達及CDX1 對上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響，評估CDX1作為胃癌化學預防和潛在靶點的可行性。現將結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 細胞系和試劑

人正常胃上皮細胞HFE145 細胞系（武漢普諾賽生命科技有限公司）；Hp 野生型60190 菌株和CagA敲除60190ΔA 菌株（青旗上海生物技術發展有限公司）；CagA 陽性質粒WT-CagA 和陰性質粒pcDNA3.1（韓國延世大學李勇教授提供）；慢病毒轉導人CDX1 shRNA（SC-35731-V，大連寶生物工程有限公司）；轉染試劑Lipofectamine2000（賽默飛世爾，919437）；嘌呤霉素（MedChemExpress LLC，純度99.87%，419E0418）；E-cadherin、Vimentin、N-cadherin 一抗（圣克魯斯生物技術，A-AJ1249a、WL00742A、LO-ANR-082-50）；RIPA Lysis and Extraction Buffer、BCM 蛋白定量試劑盒、ECL 發光檢測試劑盒（碧云天生物科技有限公司，89900、P1511-1、36223ES60）。

1.2 細胞培養

HFE145 細胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養于37℃、5%CO2的細胞培養箱中，隔天換液，細胞生長至70%～80%的致密度時用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳至3～4 代后進行實驗。

1.3 CagA 對HFE145 細胞影響

將細胞調整于5×105細胞/孔接種于6 孔版，37℃培養20 h，無菌PBS 洗滌1 次，以100∶1 的感染倍數添加60190 菌株和60190ΔA 菌株分別為60190 組、60190ΔA 組，空白組不加細菌，僅加培養基。24 h 后采用倒置顯微鏡觀察細胞形態。

1.4 細胞轉染

將細胞分為對照組、陰性組、CagA 組和聯合組，分別采用Lipofectamine2000 轉染空白試劑、pcDNA3.1、WT-CagA、WT-CagA 聯合SC-35731-V，嚴格按照說明書操作。

1.5 Transwell 小室法檢測轉染后細胞遷移及侵襲能力

按“1.4”項下方法轉染后，將細胞以5×103細胞/孔均勻接種于鋪有基質膠的Transwell 小室底部，再將小室置于10%FBS 培養基的孔板中培養，24 h 后取出小室，清洗后采用多聚甲醛固定細胞，結晶紫染色，鏡檢計數。細胞遷移實驗除不使用基質膠外其余步驟與侵襲實驗相同。

1.6 Western blot 法檢測轉染后細胞中CDX1、CagA、E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達水平

Wester blot 法檢測轉染后四組CDX1、CagA、E-cadherin、Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達水平，以GAPDH 為內參。

1.7 熒光素酶報告基因實驗

采用引物正向：5’-CTCGAGGATCCCGATTCACAAAC-3’和反向：5’-AAGCTTCAACCCATCCAACC-3’擴增CDX1 啟動子片段，然后用PCR 技術克隆到pGL3堿性熒光素酶載體中。為了測定CDX1 啟動子中CagA 的結合位點，將CDX1 啟動子的1000 bp 片段分為Mut 500 和Mut 1000，并進行了相同的克隆實驗（Mut 500 引物，正向：5’-CTCGAGACTCCAGCTTCCATGA-3’和反向：5’-AAGCTTCACCCTGACTC-3；Mut 1000 引物，正向：5’-CTCGAGGGATTCCGATTCACAAAC-3’和反向：5’-AAGCTTTCCCTGGAATGCACAAAC-3’）。將WT-CagA 克隆到HA 標記的pSP36SR 載體中。HFE145 細胞細胞以6×105細胞/孔的密度接種于6 孔板中。用LT1（Mirus Bio LLC）與1.3 μg CagA cDNA psP65SR 載體、1 μg CDX1 啟動子熒光素酶質粒和20 ng pNL1.1 質粒（Promega 公司）共轉染細胞。2 d 后，收集細胞，裂解，并使用Nano-Glo 雙熒光素酶報告系統（Promega 公司）分析熒光素酶活性。

1.8 統計學方法

采用SPSS 23.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 法，兩組間比較采用t 檢驗。以P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CagA 對HFE145 細胞生長的影響

空白組和690190ΔA 組HFE145 細胞呈多形或樹形，細胞輪廓清晰，胞核、胞漿分界清楚；60190 組HFE145 細胞拉長，呈現典型“蜂鳥表型”。見圖1。

圖1 CagA 對HFE145 細胞生長的影響（200×）

2.2 CagA 轉染對HFE145 細胞CagA 和CDX1 蛋白表達的影響

對照組和陰性組未見CagA 表達，CagA 組和聯合組CagA 蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。CagA 組CDX1 蛋白表達水平高于對照組和陰性組（P ＜0.05）；聯合組CDX1 蛋白表達水平低于CagA 組（P ＜0.05）。見圖2。

圖2 CagA 轉染對HFE145 細胞CagA 和CDX1 蛋白表達的影響

2.3 CagA 對HFE145 細胞遷移及侵襲能力的影響

CagA 組HFE145 細胞侵襲及遷移能力高于對照組和陰性組（P ＜0.05），聯合組HFE145 細胞侵襲及遷移能力低于CagA 組（P ＜0.05）。見圖3。

圖3 CagA 對HFE145 細胞遷移及侵襲能力的影響

2.4 熒光素酶報告基因實驗結果

缺失CDX1 外顯子上游501～1000 堿基對不抑制熒光素酶活性，缺失1～500 堿基對抑制熒光素酶活性。見圖4。

圖4 熒光素酶報告基因實驗結果

2.5 CagA 轉染對EMT 相關蛋白的影響

CagA 組E-cadherin 蛋白表達水平低于對照組和陰性組（P ＜0.05），聯合組E-cadherin 蛋白表達水平高于CagA 組（P ＜0.05）。CagA 組Vimenti 和N-cadherin 水平高于對照組和陰性組（P ＜0.05），聯合組Vimenti 和N-cadherin 水平低于CagA 組（P ＜0.05）。見圖5。

圖5 CagA 轉染對EMT 相關蛋白的影響

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，胃癌的發生包括彌漫性慢性胃炎、黏膜萎縮、腸化生、上皮內瘤變、浸潤性胃癌等過程，Hp 感染促進腸化生的發展，作為胃癌前病變，腸化生已被廣泛研究，但其形成和發展尚未完全闡明[11-13]。本研究結果顯示，Hp 分泌的毒力因子CagA 可促進CDX1 的異常表達，促進細胞侵襲或遷移，誘導EMT 轉化。既往研究顯示，CDX1 是癌前病變向腫瘤性病變轉換的重要機制，CDX1 基因敲除可逆轉癌前病變的轉化[14]。本研究及前期研究均顯示其可誘導EMT 分化和癌前病變。

既往研究[15]顯示，Hp 感染可誘導CDX1 表達，導致慢性炎癥，隨后胃上皮細胞凋亡增加，導致萎縮、分化狀態改變、化生和表達腸標志物的腸細胞樣細胞出現。CDX1 上調轉錄因子，如SALL4、KLF5（27）和PPARγ，促進胃上皮細胞向腸上皮細胞的轉分化[16]。對668 例胃癌患者的臨床研究顯示，PPARγ 表達可預測腸型胃癌患者的預后，但對彌漫型胃癌的預后無預測作用[17]。由于CDX1 在顯示腸化生的胃和食管組織中的表達水平高于正常水平[18]，本研究揭示的功能可能有助于理解萎縮性胃炎和腸化生。

缺失CDX1 外顯子上游501～1000 堿基對不抑制熒光素酶活性，缺失1～500 堿基對抑制熒光素酶活性，提示CagA 相關因子的潛在結合位點位于指定區域，在CDX1 外顯子上游保留1～500 個堿基對的截短突變下，熒光素酶活性增加可能是由于啟動子面積縮短而增加了結合親和力，證實CagA 依賴性CDX1 的表達，并確定CagA 相關因子的潛在結合位點。CDX1 沉默部分逆轉了CagA 轉染細胞的侵襲表型，降低了EMT 相關蛋白的表達，恢復了正常上皮標志物的表達，這一結果支持了腸化生至少可以部分逆轉的觀點。盡管最近的研究發現根除Hp 可部分逆轉癌前病變，但根除Hp 后腸上皮化生的可逆性仍存在爭議[19-22]。抗糖尿病藥物二甲雙胍在體外和體內的作用與CDX1抑制相似：逆轉腫瘤干細胞樣表型，抑制腫瘤發生和腫瘤生長，提高對某些化療藥物的敏感性。研究顯示，二甲雙胍抑制腫瘤生長的途徑包括：抑制細胞周期相關蛋白、激活AMPK（40）抑制mTOR 途徑以及抑制胰島素分泌和IGF-1 信號傳導，CDX1 可能是二甲雙胍的另一個靶點，具有腫瘤啟動潛能的癌細胞群對其能量產生的反應更多地是氧化磷酸化而不是糖酵解，二甲雙胍是一種有效的氧化磷酸化抑制劑，它有可能抑制了這些氧化磷酸化依賴性癌干細胞的活性，而這恰好是CDX1 表達細胞的一個主要特征[23-24]。動物研究[25]顯示，二甲雙胍治療異種移植小鼠后CDX1 表達減少。提示使用可能抑制與CDX1 表達相關的表型變化的藥物，例如在發生萎縮或腸化生后使用二甲雙胍可能對預防病情進展有利。

總之，本研究發現Hp 毒力因子CagA 誘導的CDX1的異常表達促進胃上皮EMT，靶向性抑制CDX1 在逆轉EMT 發生發展和胃癌防治的作用具有進一步研究的價值。