野生動物源腸桿菌科細菌鑒定及同源性分析

劉龍海，黃淑芳，應志豪，張秀秀，陳玎玎，龔利洋，鄭應婕

(杭州動物園，浙江 杭州 310008)

腸桿菌科細菌廣泛存在于人、動物和自然環境中，腸桿菌科細菌的致病性差異很大，大多數種類為條件性致病菌，可附殖于健康動物的體表和消化道，也有部分細菌為致病性菌，如沙門桿菌屬、志賀桿菌屬[1]。革蘭氏陰性桿菌，特別是大腸埃希氏屬是引起園內感染最常見細菌之一，常引發泌尿道感染、腸炎、腦膜炎、敗血癥等[2]。在野生動物上，腸桿菌科細菌極易感染哺乳動物和禽類，特別是幼齡動物，且死亡率較高[3]。

基于生化反應和抗原構造的分類方法，可將腸桿菌科細菌分為5個族12個屬，而通過生化反應和DNA數據分析，分類更加準確細化，可將其分為25個屬[4]。16S rDNA聚合酶鏈式反應是目前細菌鑒定中最為準確、高效的手段，通過與NCBI基因數據庫中的已知菌株數據作對比，可快速確定細菌種類[5-6]。同種腸桿菌的亞型分類對腸桿菌遺傳進化和溯源有重要意義，主要的方法有血清型分型法、基因重復序列聚合酶鏈式反應(ERIC-PCR)、脈沖場凝膠電泳(PFGE)、多位點序列分型(MLST)、基質輔助激光解吸飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)等[7]。其中，ERIC-PCR 技術以其操作簡單、試驗重復性高和分辨力強等優點而被廣泛利用，常用于腸道菌群和細菌的同源性分析[8]。Huiyong Duan 等對豬場空氣和糞便分離的120株大腸埃希菌進行ERIC-PCR分析，結果發現空氣分離菌來自于糞便[9]；Soltani等通過凝膠電泳從95個樣本中識別出65個不同的禽大腸桿菌菌株，其中有232～2690 bp條帶，并在廉價和簡單的分子工具中證實ERIC-PCR是一種很好的細菌基因分型技術[10]。在其他細菌的基因分型中，也有研究驗證了ERIC-PCR的可行性，李鵬等根據副豬嗜血桿菌 15 種血清型的特異性 ERIC 指紋圖譜，對中國東南部不同豬場的111株副豬嗜血桿菌樣品進行鑒定，驗證了ERIC-PCR在其他細菌基因型分型的應用[11]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 從患病野生動物的患處膿液、死亡動物內臟、野生動物生活環境中經分離的細菌，經生化鑒定的腸桿菌科細菌38株。

1.1.2培養基及試劑 生化鑒定試劑盒、營養肉湯培養基、麥康凱培養基、營養瓊脂培養基、細菌DNA提取試劑盒、細菌16S rDNA擴增試劑盒(大連寶生物工程有限公司)、超純水、50×TAE緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)、Premix Taq(大連寶生物有限公司)。

1.1.3儀器設備 恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)、PCR儀(賽默飛世爾科技)、電泳儀(北京六一有限公司)凝膠成像儀(北京科銳創新科技有限公司)、微量移液槍(Eppendorf)。

1.2方法

1.2.1細菌DNA的提取 使用Takara公司，細菌提取試劑盒提取保存細菌的DNA。

1.2.216S rDNA和ERIC-PCR擴增 使用Takara公司的細菌16S rDNA的鑒定試劑盒，擴增保存腸桿菌DNA的16S rDNA序列，對擴增PCR產物使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，檢驗是否擴增成功。將擴增產物送華大基因(北京)測序，并將結果在NCBI數據庫中比對。

用于ERIC-PCR擴增的引物序列參照文獻設計，上游引物為：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；下游引物為：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAG CG-3′。反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃復性45 s，72 ℃延伸3 min，30個循環，72 ℃延伸10 min。對擴增產物使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。

2 結果

2.1腸桿菌科細菌16S rDNA鑒定結果 38株腸桿菌科細菌的16S rDNA擴增片段(部分)瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。

圖1 38株腸桿菌科細菌的16S rDNA擴增片段(部分)瓊脂糖凝膠電泳圖

擴增片段經華大基因公司(杭州)測序后，將測序結果與NCBI數據庫已有序列比對，結果發現克雷伯氏菌4株，埃希氏菌27 株，摩氏摩根菌2株，沙門氏菌1株，弗氏檸檬酸桿菌1株，哈夫尼氏菌2株，勒克氏菌1株，如表1所示。

表1 腸桿菌科細菌16S rDNA鑒定結果

使用MEGA 6.0軟件，對27株埃希氏菌16S rDNA序列使用臨近法構建系統發生樹，結果如圖2所示。

圖2 27株埃希氏菌16S rDNA序列系統發生樹

從構建的系統發生樹中發現，置信度在90%可分為23個亞群，其中E1和E26，E5、E6、E17和E18，進化關系較近。

2.2埃希氏菌ERIC-PCR指紋圖譜 對ERIC-PCR擴增產物，使用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，部分結果如圖3所示。

圖3 埃希氏菌ERIC-PCR擴增產物(部分)

通過對電泳條帶統計，每株埃希氏桿菌擴增出0-8條條帶，共擴增出不同條帶11種，其中E5、E14、E16未擴增出條帶，使用NTSYSpc2.0軟件，對擴增條帶進行遺傳相似度分析，結果如圖4所示。

圖4 埃希氏菌ERIC-PCR指紋圖譜遺傳相似度分析

通過對ERIC-PCR 指紋圖譜分析，在相似系數為0.87時，埃希氏菌屬可分為18個亞群，其中E1和E22，E6和E7，E8和E23，E26和E27，E17和E18遺傳相似度較高。

3 討論

16S rDNA基因是原核生物核糖體小亞基rDNA(16S rDNA)的基因，是細菌分類學研究中最常用、最有用的“分子鐘”，全長序列包含10個可變區，可精確指示細菌之間的親緣關系，所含信息能反應生物界進化關系，易操作，適用于各級分類單元。本研究，通過擴增腸桿菌的16S rDNA的全長序列、測序和比對，確定了臨床分離細菌7個屬38株腸桿菌科細菌。利用16S rDNA序列信息，進一步通過MEGA6.0軟件構建27株埃希氏菌屬細菌系統發生樹，若把置信度定位在90%時，則可以分為23個亞群。在確定遺傳關系上，ERIC-PCR指紋圖譜技術比16S rDNA基因分析更具有鑒別性[12]。本文中77.8%(n=21)埃希氏菌屬細菌ERIC-PCR電泳結果顯示出獨特條帶，表明菌株之間非相同菌株傳播。經遺傳聚類分析，在相似系數為0.87時，埃希氏菌屬菌可分為18個亞群，顯示其傳播情況為非同株菌的爆發式傳播。

在本研究中，通過16S rDNA序列信息構建的系統發生樹中，置信度在90%時，可分為23個亞群，其中E1和E26，E5、E6、E17和E18，進化關系較近；而在通過對ERIC-PCR 指紋圖譜分析，在相似系數為0.87時，埃希氏菌屬菌可分為18個亞群，其中E1和E22，E6和E7，E8和E23，E26和E27，E17和E18遺傳相似度較高。從兩種分析結果來看有所差異。然而，在ERIC-PCR 指紋圖譜分析時，在相似系數為0.75時，可分為12個亞群，排除未出現條帶的E5、E14、E16，有1個亞群包含16S rDNA序列信息構建的系統發生樹中置信度大于90%的所有菌株。

本研究中，通過細菌的16S rDNA快速鑒定細菌種類，并結合ERIC-PCR 指紋圖譜分析快速分析出埃希氏菌屬細菌的遺傳關系，在今后腸桿菌科細菌感染的快速鑒定、分類和遺傳溯源上有一定的指導意義。然而，在ERIC-PCR 指紋圖譜分析中，E5、E14、E16未出現有效條帶，需進一步研究，分析原因。