COPD患者肺泡灌洗液中免疫球蛋白、淋巴細胞亞群及iNOS的表達及相關性

陳秀蘭

福建省老年醫院呼吸與危重癥醫學科,福建省福州市 350001

慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種嚴重威脅全球公眾健康的慢性呼吸道疾病，尤其是老年患者，以不完全可逆的氣流受限為特征，已證實病情的發展與抽煙、環境污染、感染等存在明顯關系，由于異常炎癥反應的持續存在，進行性的削弱機體免疫功能，包括體液免疫和細胞免疫[1]。目前，對不同GOLD分組的COPD患者肺泡灌洗液中免疫球蛋白、淋巴細胞亞群、誘導型一氧化氮合成酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)的相關性研究尚少。本文以不同分組COPD患者作為研究對象，檢測其Ig、淋巴細胞亞群、iNOS的水平，并探討各組免疫狀態及與iNOS相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 160例COPD患者均為我院住院或門診的患者，均符合慢性阻塞性肺病診斷標準《慢性阻塞性肺疾病基層診療指南(2018年)》[2]。所有COPD患者以肺功能水平(第1秒呼氣容積占預計值的百分比FEV1%pred)進行分組。其中，A組為FEV1pred≥80%；B組為50%≤FEV1pred<80%；C組為30%≤FEV1pred<50%；D組為FEV1pred<30%。A組40例，男25例，女15例，平均年齡(66.67±11.34)歲；B組40例，男24例，女16例，平均年齡(69.58±12.19)歲；C組40例，男26例，女14例，平均年齡(69.54±11.26)歲；D組40例，男22例，女18例，平均年齡(71.21±13.41)歲；選取同期健康者40例作為對照組，男20例，女20例，平均年齡(66.74±10.26)歲。比較五組研究對象一般資料，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，且所有研究對象均經過我院倫理委員會要求，同時簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 免疫比濁法：免疫球蛋白試劑(德國羅氏公司)，采用日立全自動生化分析儀檢測各組肺泡灌洗液中IgA、IgG、IgM的表達。

1.2.2 淋巴細胞亞群檢測：流式細胞儀分析CD4+、CD8+T、B和NK淋巴細胞亞群(Beckman Navios型號)，八色熒光抗體試劑(Beckman公司提供)。

1.2.3 RT-PCR檢測iNOS mRNA的表達：每組取1ml的肺泡灌洗液懸液，加入200μl的Trizol裂解液中，先提取總RNA，并按照逆轉錄試劑說明書逆轉錄為cDNA，iNOS和β-actin引物序列，見表1。擴增PCR反應體系，反應條件：94℃預變性90s；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循環40次；最后72℃延伸5min。每份標本3個復孔，復孔間Ct值差異<0.5，以β-actin為內參，Ct值減去內參的Ct值作為△Ct，用2-△△Ct表示目的基因的表達量。

表1 依據GenBank序列設計引物

1.2.4 ELISA法檢測NO和IL-6水平：收集各組患者肺泡灌洗液，酶聯免疫吸附試驗檢測NO和IL-6表達水平，嚴格按說明書操作。

2 結果

2.1 免疫球蛋白水平 四組COPD患者中IgM、IgA水平測定水平與對照組比較無明顯差異，兩兩比較差異無統計學意義(P>0.05)。除A組外，B組、C組、D組患者IgG的檢測水平均高于對照組，比較差異具有統計學意義(t=9.436、11.754、13.421，P<0.05)，見表2。

表2 各組COPD患者IgM、IgA和IgG水平比較

2.2 淋巴細胞亞群水平 四組CD4+T細胞計數和CD4+T/CD8+T比值均顯著低于對照組，隨著分組級別越高，顯著性更明顯，差異具統計學意義(P<0.05)。四組患者CD8+T計數水平較對照組明顯升高，二者比較差異具有統計學意義(t=9.258、11.631、14.135、12.962，P<0.05)。B組、C組、D組與對照組、A組CD3-CD19+比較明顯升高，差異均有統計學意義(均P<0.05)。B組、C組、D組與A組、對照組NK細胞比較均明顯下降，差異均有統計學意義(均P<0.05)，見表3、表4。

表3 各組T淋巴細胞亞群水平比較

表4 各組B和NK淋巴細胞亞群水平比較個/μl)

2.3 iNOS、NO和IL-6水平 除A組外，其他三組iNOS水平均較對照組明顯升高，且進行性升高，兩兩比較差異具有統計學意義(均P<0.05)。B組、C組、D組的NO和 IL-6水平與對照組比較明顯升高，兩兩比較差異均有統計學意義(均P<0.05)，見表5。

表5 各組iNOS、NO和IL-6水平比較

2.4 iNOS與IgG、CD4+T、CD8+T、CD4+T/CD8+T、NK細胞水平的相關性 采用Spearman分析相關性，發現所有COPD患者的iNOS與CD4+T、CD4+T/CD8+T、NK細胞水平呈負相關關系(相關指數r=-0.576，P<0.001；r=-0.443，P=0.019；r=-0.364，P=0.043)；iNOS與CD8+T、IgG水平存在一定正相關關系(相關指數r=0.512，P<0.001；r=0.401，P<0.001)；iNOS與B淋巴細胞水平無明顯相關性(相關指數r=0.102，P>0.05)。

3 討論

COPD是一種慢性氣道炎癥性疾病，但并不僅局限于氣道，對全身的各個系統影響也不容忽視，尤其是機體免疫系統，長期的慢性炎癥刺激，各種淋巴細胞功能均有相應的變化，其中以CD4+T淋巴細胞減少為特征，常并發嚴重感染[3]。人體內輔助性T細胞破壞，細胞免疫功能下降，并繼發體液免疫功能下降，隨即出現免疫球蛋白含量異常變化，參與機體的體液免疫調節，在機體抵抗病原體感染過程中的起重要作用[4]。T淋巴細胞具有多種生物功能細胞亞群，包括有CD4+T、CD8+T等，其中CD4+T細胞既可促進細胞免疫，又可分泌促炎性因子，可分為Th1、Th2、Th3等，主要分泌IL-2、TNF-β、IFN-γ及IFN-α等，參與介導細胞毒活性，增強吞噬細胞、NK細胞功能，調節局部炎癥免疫應答，促進細胞免疫和輔助抗體生成。CD4+T細胞還可分泌IL-4、IL-5等，刺激B淋巴細胞增殖，參與體液免疫應答，生成大量免疫球蛋白如IgG、IgA等，協同細胞免疫，發揮抗體的潛力，保護機體免受感染[5-7]。CD4+T細胞能促進其他T細胞的分化成熟，也可參與體液協助B細胞產生Ig，是機體重要的免疫調節細胞。本研究通過檢測各組肺泡灌洗液中免疫球蛋白、淋巴細胞、iNOS的表達，結果發現隨著臨床分組級別越高CD4+T細胞下降越明顯，且與iNOS水平呈負相關[8-9]。iNOS分布于多種細胞中，如：巨噬細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、角質化細胞和血管平滑肌細胞等，可產生大量NO，促進組織和細胞損傷，可刺激機體產生NO、IL-6等下游炎癥介質。本研究結果顯示iNOS表達與CD8+T水平存在一定正相關關系，早期監測CD8+T基線水平可提前預知患者炎癥水平高低，可作為治療期間評估指標[10-12]。本文對COPD不同階段Ig分析，A組患者炎癥水平尚不活躍，相對靜止狀態，IgG表達水平尚未被完全激發，隨著COPD級別升高，可因疾病嚴重程度而刺激性增加。相關性分析發現COPD患者Ig與iNOS水平水平存在一定正相關，說明體液免疫起著關鍵的作用。與對照組相比，COPD患者的IgG顯著升高，各種機會性感染概率上升，可反映COPD疾病發生的轉歸。筆者發現COPD患者四組中，IgA、IgM水平測定與健康對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，仍需進一步證實。

綜上所述，不同階段COPD患者的免疫功能因疾病分級存在差異，縱向比較發現Ig、淋巴細胞亞群與iNOS之間變化水平，提示CD4+T、Ig和iNOS在判斷病情嚴重程度、評估炎癥水平方面起著重要作用，可將iNOS及NO、IL-6等下游炎癥因子作為評估炎癥嚴重程度的預測指標。