時鐘基因Rev-erbα對心肌缺血再灌注損傷保護機制的研究進展

田浩，張藝，熊永紅，夏中元

(武漢大學人民醫院麻醉科，武漢 430060)

心血管疾病是21世紀影響人類健康的首要問題，《中國心血管健康與疾病報告2019》[1]顯示：中國有大約3.3億心血管疾病患者，其中冠心病患者1 100萬。包括冠心病在內的一系列缺血性心臟疾病的防治一直是臨床研究的重點。恢復血液循環是缺血性心肌病治療的關鍵，臨床上采取各種措施來疏通梗阻的血管，以保障心肌有效的血液供應。然而心肌在恢復血供后往往會出現損傷加重的現象，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。目前，MIRI的發生機制仍未完全明確，普遍認為再灌注時氧自由基爆發、鈣超載、腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)能量代謝障礙、細胞自噬、細胞鐵死亡、炎癥、血管內皮細胞功能障礙等是缺血再灌注損傷病理過程發生發展的重要原因[2]。近年來，時鐘基因Rev-erbα在MIRI中的相關保護機制研究逐漸增多[3-4]，因而人們對缺血性心臟疾病的防治也有了新的認識。時鐘基因Rev-erbα是核受體超家族的成員，涉及許多生理和病理過程的調控，如睡眠障礙、能量代謝。近年來關于時鐘基因與人類疾病關系的研究不斷增多，據相關研究報道，時鐘基因Rev-erbα參與糖尿病心臟病、動脈粥樣硬化、心肌肥大等心血管疾病的病理生理進程[5-6]。現就Rev-erbα在MIRI保護機制中的相關研究進展予以綜述，以期為缺血性心臟疾病的防治提供新思路。

1 晝夜節律與Rev-erbα

1.1晝夜節律 大多數生物通過光線、溫度和食物等來預測生存環境的日常變化，以獲得對其最佳的適應性。在動物、植物、真菌和細菌中觀察到顯著的日常行為和生理節律，這些節律被稱為晝夜節律，是晝夜節律生物鐘的自主內在計時系統的外在表現[7]。

晝夜節律計時系統由位于下丘腦視交叉上核的中樞生物鐘以及全身其他腦區和器官組織(包括肌肉、脂肪組織和肝臟)的外圍生物鐘組成[8]。視交叉上核包含大約20 000個神經元，每個神經元均被認為包含一個細胞自主晝夜節律振蕩器。視交叉上核神經元通過與視網膜的直接突觸連接來接收有關環境光強度的信息，從而使視交叉上核振蕩器的相位適應光周期。此外，視交叉上核通過神經、內分泌、溫度和攝食行為等信號同步外圍生物鐘。

分子水平上，晝夜節律由兩個連鎖的轉錄/翻譯反饋環產生，這兩個反饋環共同作用，從而產生24 h基因表達節律。核心轉錄/翻譯反饋環由4種完整的時鐘蛋白驅動：兩種激動劑晝夜節律運動輸出周期故障(circadian locomotor output cycles kaput，Clock)和腦和肌肉芳香烴受體核轉運樣蛋白1(brain and muscle ARNT-like protein 1，Bmal1)及兩種阻遏劑周期蛋白(period，Per)和隱花色素蛋白(cryptochrome，Cry)。Clock和Bmal1是堿性螺旋環-螺旋-周期蛋白-芳香烴受體核轉運蛋白-類泛素蛋白相互作用基序結構域中異二聚體復合物Clock/Bmal1的亞單位，復合物Clock/Bmal1通過與調控基因中的E-box元件結合來激活Per和Cry基因以及其他下游基因的轉錄[9]。Per和Cry蛋白在細胞質中異二聚化，并轉移到細胞核中與Clock/Bmal1相互作用，從而抑制其進一步轉錄激活。當Per和Cry蛋白通過泛素依賴性途徑降解時，它們對Clock/Bmal1的抑制被解除，循環以24 h周期再次開始[10]。第二個轉錄/翻譯反饋環是通過視黃酸相關孤兒受體(α、β、γ)的轉錄激活和Rev-erbα/Rev-erbβ的抑制產生。轉錄/翻譯反饋環驅動Bmal1轉錄的節律性變化，并導致Cry1基因表達延遲，從而使其與由Clock/Bmal1嚴格調控的基因相抵消[11]。協同、連鎖反饋回路的存在有助于保持準確的晝夜節律時間，也有助于在晝夜節律轉錄輸出中產生相位延遲。

1.2Rev-erbα Rev-erb亞家族包含兩個成員：Rev-erbα(也稱NR1D1)和Rev-erbβ(也稱NR1D2)[12]。Rev-erbα于1989年被發現，并定位到編碼另一個核受體甲狀腺激素受體α基因的反向鏈上，其結構與甲狀腺激素受體和視黃酸受體最相似，但不結合甲狀腺激素或視黃酸。與配體調節的核受體相反，Rev-erbα缺少配體結合域C端激活螺旋-H12，因而是一種孤兒核受體[13]。Rev-erbα顯示出一個疏水區域，在該區域招募了如核受體共抑制因子的共阻遏物。Rev-erbα通過與核受體共抑制因子結合而發揮顯性轉錄沉默子的作用。因此，Rev-erbα常充當轉錄的組成型阻遏物。

在哺乳動物中，Bmal1和Clock激活Cry和Per基因的轉錄。Per和Cry蛋白一旦達到臨界濃度就會通過翻譯后調節抑制自身的合成[14]。而Rev-erbα的轉錄被Bmal1-Clock異二聚體激活，同時也被Cry和Per蛋白抑制，導致Rev-erbα基因表達的晝夜節律振蕩。反過來，Rev-erbα抑制Bmal1和Clock基因的表達，反饋回路的正負分支也因此銜接起來。Rev-erbα反饋調節核心時鐘成分Bmal1的轉錄，以穩定晝夜節律振蕩。此外，Rev-erbα在其他分子鐘調節器的節律方面也具有轉錄抑制作用，包括Clock、Cry1、白細胞介素-3調節相關轉錄因子和神經PAS域蛋白2等[15]。因此，Rev-erbα作為分子鐘的整合者，具有通過與多個基因的調控相互作用改變整體細胞振蕩的潛力。

2 Rev-erbα在MIRI中的作用

許多疾病的癥狀和發病模式在24 h內并非隨機分布，往往伴有一定的晝夜節律性。Muller等[16]將血漿肌酸激酶水平首次升高的時間作為客觀確定心肌梗死的發作時間，觀察發現與23:00相比，9：00點心肌梗死的發作頻率增加了3倍，證實了心肌梗死發作晝夜節律的存在。據報道，在動物實驗[17]和臨床試驗[18]中，晝夜節律可調節心肌細胞對缺血再灌注損傷的耐受性。在睡眠-覺醒轉換時通過抑制 Rev-erbα活性可以賦予心肌缺氧-復氧耐受性，改善MIRI[18]。近年相關研究發現，在炎癥反應[4]、自噬[19]、氧化應激[20]以及代謝[3]等機制方面通過調控時鐘基因Rev-erbα可起到一定的心肌保護作用。藥物和缺血預處理是目前治療MIRI的主要方法。雖已證實了各種缺血預處理手段的安全性，但由于臨床效果不同，還需進一步臨床試驗[21]。目前臨床上使用的藥物大多是針對MIRI的發生機制，減輕炎癥反應，減少氧自由基、自噬及改善內皮功能等[22]。因此，探索時鐘基因Rev-erbα與MIRI之間的潛在聯系可為缺血性心臟疾病的治療提供新方向。

2.1Rev-erbα與炎癥反應 心肌細胞缺血壞死觸發強烈的炎癥級聯反應，其功能是清除受損心肌中死亡的細胞，并為激活修復過程奠定基礎。及時抑制炎癥反應并在空間上遏制炎癥反應對防止損傷的擴大尤為必要，過度活躍甚至失調的炎癥反應可能導致心肌細胞死亡[23]。

缺血再灌注的缺血期與基因表達的轉錄控制顯著改變有關。由于需要氧作為輔助因子，缺血可引起氧敏感脯氨酰羥化酶的抑制。脯氨酰羥化酶的抑制導致核因子κB的活化，有助于限制細胞凋亡[24]。核因子κB的經典途徑能夠調節炎癥，協調免疫反應和組織穩態。其中IκB激酶β途徑與脯氨酰羥化酶-缺氧誘導因子途徑的成員相互作用，將炎癥與缺氧聯系起來[25]。對炎性腸病小鼠模型的研究表明，腸炎癥中脯氨酰羥化酶可調節核因子κB介導的抗凋亡作用[26]。此外，腸缺血再灌注時腸上皮細胞中的核因子κB被激活，進而增加腫瘤壞死因子-α的產生，但同時減弱腸上皮細胞凋亡。一項關于血管平滑肌細胞的研究表明，Rev-erbα可增強腫瘤壞死因子-α誘導的核因子κB的激活，進而上調炎癥標志物(如白細胞介素-6、環加氧酶-2)的表達[27]，可見Rev-erbα與核因子κB通路之間存在調節關系。因此，通過介導時鐘基因Rev-erbα及其相關免疫反應，抑制細胞凋亡有望成為MIRI的治療策略。

2.2Rev-erbα與細胞自噬 自噬普遍存在于缺血、功能衰竭和衰老的心肌中，可以回收受損的細胞器，提供細胞營養，維持基礎體內平衡[28]。自噬是指機體通過特定機制調節細胞內成分的有序降解和再生循環，并以雙層膜結構包裹部分胞質和細胞器的自噬小體為特異性指標。研究發現，自噬激活現象存在于心肌梗死后存活的心肌細胞中，透射顯微鏡下可觀察到自噬小體[29]。而應用哺乳動物雷帕霉素增強自噬水平后，心肌重塑減輕，心臟功能恢復。

自噬在MIRI中處于關鍵地位[30]。心肌缺血期時，自噬水平的增強使細胞內受損細胞器得到清理，這可能是機體在心肌缺血過程中的一種自我保護；而再灌注期時，自噬水平過度激活，誘發細胞程序性死亡，從而加重心肌損傷。因此，自噬在MIRI的不同時期發揮不同的作用。而Pastore和Ballabio[31]發現伴隨Rev-erbα的敲除，自噬基因和自噬流量的表達增強。據報道，經過Rev-erbα激動劑SR9009處理后，自噬相關基因表達減少，證實Rev-erbα的激活可以通過調節自噬相關通路來保護腸道屏障功能[32]。同樣，Shen等[19]也發現SR9009治療小細胞肺癌的作用是通過Rev-erbα依賴的自噬抑制介導。以上研究表明，時鐘基因Rev-erbα參與調控細胞自噬，提示可通過調控Rev-erbα的表達水平，減少細胞過度自噬，改善MIRI。

Song等[34]發現將大鼠及其后代暴露于環境空氣顆粒會導致Rev-erbα表達水平降低，同時肺組織和全身氧化應激水平顯著升高。此外，Sengupta等[20]研究表明，Rev-erbα通過增強線粒體功能維持細胞代謝來控制細胞內環境穩定，從而提高機體對氧化應激的耐受性。同時Rev-erbα的穩定化可以增加線粒體活性氧類，而線粒體活性氧類對細胞具有保護作用，與缺血再灌注損傷密切相關[35]。綜上，Rev-erbα在抗氧化防御系統中發揮重要作用，推測可以時鐘基因Rev-erbα作為靶點來對抗氧化應激，改善MIRI。

2.4Rev-erbα與代謝異常 能量代謝障礙被認為是缺血再灌注損傷發生的重要環節，而線粒體被視為細胞的動力源，以ATP的形式產生能量。因此，線粒體數量和功能的改變與能量代謝有直接聯系。Rev-erbα以代謝物血紅素為內源性配體，可參與線粒體呼吸和細胞氧化還原平衡，且在聯系新陳代謝與晝夜節律中扮演重要角色[36]。因此，Rev-erbα可作為細胞代謝狀態的傳感器，將生物時鐘與代謝平衡密切聯系起來。當心肌細胞缺氧時，心肌能量代謝發生改變，糖酵解產生的ATP逐漸成為維持心肌細胞存活的唯一能量來源，但糖酵解產生的ATP遠不能滿足心肌細胞的需求，同時過度的脂肪酸β氧化使得耗氧增加，最終加重心肌細胞損傷。

據報道，Rev-erbα的穩定化可以增強成纖維細胞的線粒體呼吸[20]。相反，過表達的Rev-erbα能以血紅素依賴性的方式限制肝癌細胞中線粒體的呼吸作用。Woldt等[37]發現，體外Rev-erbα的過表達增加了線粒體的數量，而體內肌肉中Rev-erbα的過表達或藥理激活增加了運動能力。以上研究表明，Rev-erbα在調節線粒體數量和功能中起重要作用。因此，Rev-erbα可能通過調節能量代謝影響MIRI的重要過程，但具體機制仍未闡明。

2.5Rev-erbα與其他 纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)是纖維蛋白溶解的主要抑制劑，可在脂肪組織中表達，并呈現晝夜表達模式。研究表明，Rev-erbα通過PAI-1啟動子中的兩個Rev-erbα結合位點抑制人PAI-1基因表達[38]。PAI-1轉基因小鼠會出現自發性的年齡依賴性冠狀動脈血栓形成[39]。有證據表明，PAI-1水平的升高可能促進動脈粥樣硬化血栓形成的發展[40]。因此，通過調控Rev-erbα可以改善心血管凝血功能。

心肌缺血再灌注時，大量的活性氧類由內皮細胞產生，且抗氧化活性也大大降低，當大量的活性氧類超過內皮細胞的防御系統能力可導致心肌細胞損傷。一氧化氮是一種由內皮細胞產生的強大擴血管物質，且具有抑制血小板和白細胞黏附、限制平滑肌細胞增殖的作用，因此在MIRI中具有重要保護作用。血管內皮一氧化氮依賴性血管舒張功能下降可導致內皮細胞更易受氧自由基的損害，從而加重MIRI易損性。有研究表明，Rev-erbα是一氧化氮的直接靶點，且其介導的轉錄抑制可被一氧化氮逆轉[41]。嚙齒類動物的肺動脈高壓模型證明，一氧化碳誘導內皮細胞產生一氧化氮，并最終促進正常動脈和血管大小的恢復[42]。另一項研究表明，一氧化碳可增加缺血再灌注損傷時大鼠心臟組織中蛋白激酶B的表達[43]。蛋白激酶B是一種對細胞存活和代謝至關重要的絲氨酸-蘇氨酸激酶，而蛋白激酶B的磷酸化與Rev-erbα表達呈負相關[6]，因此推測Rev-erbα與雙原子氣體一氧化碳和一氧化氮之間形成了調控環路，通過改善血管的舒張功能影響MIRI。綜上，當時鐘基因Rev-erbα受到干擾時可能會引發內皮功能障礙和血栓形成的狀態，最終加重MIRI。

3 小 結

晝夜節律的紊亂與多種疾病的發生發展密切相關，其中時鐘基因Rev-erbα是晝夜節律的一個重要組成部分。Rev-erbα在多個組織中表現出強烈的晝夜節律振蕩，且在代謝、免疫、炎癥等方面有重要影響，因此成為近年的研究熱點。目前MIRI的病理機制仍未完全闡明，且缺乏有效的防治措施，而通過調節時鐘基因Rev-erbα在氧化應激、細胞自噬、炎癥反應等方面的作用，可以限制MIRI的易損性增加，進而起到一定的心臟保護作用。事實上，在某些情況下調節Rev-erbα也可以導致其他疾病病情的改善，如阿爾茨海默病、高同型半胱氨酸血癥和高膽固醇血癥等[44-46]。因此，未來時鐘基因有望作為一個新的干預靶點，成為一種安全性高和成本低廉的治療選擇。