Box?Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化羥基積雪草酸固體脂質(zhì)納米粒的處方及體外釋藥行為研究

彭祎婧,羅懷青，丁勁松，黎 綾，趙雅芝,胡明華，馬 寧

瘢痕增生是外科常見的一類皮膚疾病。我國傳統(tǒng)中藥積雪草，在臨床上有廣泛應(yīng)用。然而，積雪草現(xiàn)有制劑因半衰期短，積雪草苷片，軟膏等需每日三次給藥,連續(xù)治療3~6個(gè)月才會(huì)顯效，易引起肝毒性[1-2]。另外，由于皂苷類成分水溶性大，在腸道或皮膚上的吸收較差[3]，使得現(xiàn)在臨床上用的積雪草類藥品生物利用度低、起效慢。因此開展新型制劑的研究對解決臨床用藥問題是十分必要的。羥基積雪草酸（madecassic acid,MA）是積雪草有效成份之一，具有阻抑內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用，促進(jìn)傷口愈合[4]。研究表明[5]，MA 對瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用遠(yuǎn)強(qiáng)于其它皂苷類化合物。因此，本課題擬將其制成固體脂質(zhì)納米粒，解決其水溶性及透皮性能差的問題，為臨床提供新的用藥選擇。

固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticles ,SLN）是近20 年來發(fā)展較快的新型膠體給藥系統(tǒng)，適用于水不溶性或毒性大的藥物[6-7]。可利用生物相容性好并可生物降解的載體材料運(yùn)載藥物[8]，具有良好的緩控釋作用和靶向性。本課題將羥基積雪草酸制備成羥基積雪草酸固體脂質(zhì)納米粒并考察了其體外釋藥行為特征，為進(jìn)一步研發(fā)納米凝膠劑提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。(長沙湘儀貝克儀器儀表有限公司)。

1.2 藥品與試劑 羥基積雪草酸原料藥（湖北巨勝科技有限公司，批號(hào)：20191001，純度：85.5%）；羥基積雪草酸對照品（成都普思生物科技有限公司，批號(hào)：PS020268，純度：98.3%）；山崳酸甘油酯（上海延拓生物科技有限公司，批號(hào)：20190701）；大豆磷脂（上海麥克林生化科技有限公司，生物技術(shù)級(jí)）；吐溫?80（批號(hào)：20160812，上海厚誠精細(xì)化工有限公司）；泊洛沙姆188（上海厚誠精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20161025）；磷酸二氫鉀（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，AR 級(jí)）；乙腈、甲醇為色譜純（美國Tedia公司）；水為自制超純水。

1 材料

1.1 儀器 LC?20A 高效液相色譜儀（島津）；KQ?3200DB 型超聲波清洗機(jī)（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；BP211D 十萬分之一天平（德國Sartorius公司）；FB?110Q?PLUS 超高壓均質(zhì)機(jī)（上海勵(lì)途機(jī)械設(shè)備工程有限公司）；LC?FB 型剪切分散機(jī)（上海勵(lì)途機(jī)械設(shè)備工程有限公司）；UV7500紫外可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；90 plus Zeta粒徑分析儀（美國布魯克海文儀器公司）；DF?101S 恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限公司）；TGL?20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長沙湘儀貝克儀器儀表有限公司）；SHA?C水浴恒溫振蕩器（江蘇金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；JY92?IIN 超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HT7700透射電子顯微鏡（日立高新技術(shù)公司）；透析袋(MD34 分子量截止值8000~14000 d，VISKASE)；CCH?M10 超純水儀(湖南創(chuàng)純)；SHA?C 水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇金城國勝儀器廠)；RYJ?12B 藥物透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)；TGL?20M 高速離心機(jī)

2 方法

2.1 MA?SLN 的制備 采用溶劑乳化揮發(fā)?高壓均質(zhì)法制備MA?SLN。稱取處方量的山崳酸甘油酯、大豆磷脂在恒溫（90±1）℃水浴磁力攪拌下熔融，另取處方量的羥基積雪草酸加入適量無水乙醇超聲溶解后加入上述液體中混合均勻，形成油相。稱取處方量的吐溫?80（T?80）與泊洛沙姆188（P?188）分散于50 mL 水中，在同溫水浴條件下充分溶解形成水相。在 90 ℃水浴恒溫和 1000 r·min?1攪拌條件下將油相緩慢加入水相中，繼續(xù)攪拌40 min揮去有機(jī)溶劑得到粗分散液。高速剪切（10000 r·min?1）3 min 形成初乳，在高壓均質(zhì) 800 bar 下均質(zhì) 8次，冰水浴冷卻即得MA?SLN 分散液。空白SLN 的制備方法除不加藥物外，其他過程與MA?SLN 分散液制備方法相同。

2.2 MA的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Ultimate LP?C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈?10 mmol·L-1磷酸二氫鉀（60:40）；流速1 mL·min?1；檢測波長205 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 方法學(xué)考察 精密稱取羥基積雪草酸對照品9.72 mg，置于100 mL 容量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制得羥基積雪草酸對照品儲(chǔ)備液。分別從儲(chǔ)備液中移取一定量溶液，甲醇稀釋定容，配制成濃度范圍為 9.72～97.2 μg·mL?1系列對照溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。

2.3 包封率和載藥量的測定 采用透析袋法測定納米粒的包封率和載藥量。MA?SLN總藥量(M總)測定：精密量取1 mL 納米粒混懸液于50 mL 容量瓶中，甲醇超聲溶解并定容。所得溶液用0.22 μm 濾膜過濾，按“2.2”項(xiàng)下方法測定藥物總質(zhì)量濃度W總。另精密量取納米粒混懸液2 mL 置于透析袋中，密封，置于40 mL 乙醇?pH7.4 的磷酸鹽緩沖液（2:8）中，37 ℃條件下振搖30 h(150 r·min?1)，吸取適量透析介質(zhì)，過濾后按“2.2.1”項(xiàng)下方法測定游離藥物質(zhì)量濃度，記為W游。計(jì)算公式為包封率=(M總-M游)/M總×100%，載藥量=(M總-M游)/M(脂質(zhì)+藥物)×100%。

2.4 Box?Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化MA?SLN處方

2.4.1 處方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)前期處方篩查單因素考察結(jié)果，選取對納米粒性質(zhì)影響最大的三個(gè)因素[山崳酸甘油酯用量（X1），P188 與 T-80 用量比（X2），藥物含量（X3）]為考察對象，因素水平見表1。以包封率（Y1）和載藥量（Y2）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用綜合加權(quán)評(píng)分法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，綜合評(píng)分Y(OD)=0.5×Y1i/Y1max+0.5×Y2i/Y2max，利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化MA-SLN處方，實(shí)驗(yàn)安排，表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面因素及水平

按上表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及模型擬合，通過效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測，得出最佳處方和制備工藝，制得MA-SLN樣品。

2.5 MA?SLN 的質(zhì)量評(píng)價(jià) 利用透射電鏡觀察MA-SLN 的外觀形態(tài)，采用90 plus Zeta電位粒徑分析儀測定納米粒的粒徑、粒度分布及Zeta 電位。

2.6 體外釋放累積釋藥率測定 取透析袋于使用前在超純水中煮沸0.5 h，接收介質(zhì)為20%乙醇的PBS緩沖液(pH=7.4)[9]。取1.0 g MA-SLN 和自制0.25%羥基積雪草酸乙醇溶液1.0 mL 各3 份，分別置于透析袋中，兩端扎緊放入離心管，加入40 mL 接收介質(zhì)，置恒溫振蕩器，振搖。介質(zhì)溫度為恒溫37 ℃，于1、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h 取樣2.0 mL，迅速補(bǔ)充同溫度接收介質(zhì)2.0 mL。樣品經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾后HPLC 測定濃度，計(jì)算藥物各不同時(shí)間點(diǎn)的累積釋放量Qn，以累積釋藥率Q%對釋藥時(shí)間T作累積釋放曲線圖，擬合MA-SLN釋藥模型方程。

公式中，Qn代表累積釋放量;Q%代表取樣點(diǎn)n的累積釋藥率;V和V0分別代表接收介質(zhì)的體積和取樣體積;Cn 代表取樣點(diǎn)n 的藥物濃度；W 為凝膠劑中含藥量。

2.7 體外滲透試驗(yàn)

2.7.1 MA?SLN 透皮試驗(yàn) 洗凈新鮮豬耳皮膚，剪去毛發(fā)，剔除皮下脂肪，確保表皮完整，除去皮下脂肪組織和皮膚結(jié)締組織，生理鹽水洗凈后，將豬耳皮膚于冰箱?20 ℃保存，備用。在Franz立式擴(kuò)散池放置受試皮膚，滲透有效皮膚面積2.54 cm2，將皮膚角質(zhì)層朝供給室，真皮層朝接受室。在接受室中注入7.0 mL的20%乙醇的PBS緩沖液(pH=7.4)為接收介質(zhì)，將接受室置于150 r·min?1的透皮擴(kuò)散試驗(yàn)裝置中磁力攪拌，將0.79 g 羥基積雪草酸溶液劑（含MA2.17 mg)、0.55 gMA-SLN(含 MA2.17 mg)置于皮膚上，分別在1、2、3、4、6、8、10、12、24 h 分別取樣2 mL，并及時(shí)補(bǔ)充2 mL 新鮮接收介質(zhì)；樣品過0.22 μm 有機(jī)系濾膜進(jìn)HPLC 測定藥物濃度，計(jì)算累積滲透藥量，擬合滲透動(dòng)力學(xué)模型，獲得經(jīng)皮穩(wěn)態(tài)滲透速率 Js/μg. cm?2h?1。Js 為擬合模型的斜率，按下列公式計(jì)算累積滲透量Q:

公式中，Q 為累積滲透量；V 和V0分別代表接收介質(zhì)在接受室的體積和采樣體積；Cn為取樣點(diǎn)n的藥物濃度；A為滲透有效皮膚面積。

2.7.2 在皮內(nèi)滯留量的測定 透皮試驗(yàn)結(jié)束后取出豬耳皮膚，去除表面殘留的試驗(yàn)制劑，將試驗(yàn)制劑沖洗干凈，濾紙吸水，將皮膚剪碎后置15 mL 離心管，加2 mL甲醇浸泡12 h，超聲離心，0.22μm有機(jī)系濾膜濾過，HPLC測定，計(jì)算羥基積雪草酸皮膚滯留量。

3 結(jié)果

3.1 含量測定方法 以羥基積雪草酸質(zhì)量濃度（C）對峰面積（A）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=10153C+5469.3，r2=0.9998。羥基積雪草酸在9.72~97.20 μg·mL-1范圍內(nèi)，其濃度與峰面積線性關(guān)系良好。羥基積雪草酸的保留時(shí)間約為5.2 min，輔料對羥基積雪草酸的測定無干擾（圖1，2）。日內(nèi)、日間精密度RSD%小于2%；回收率在94.92%~102.85%，RSD為1.62%,溶液在48 h室溫下穩(wěn)定，本法可用于羥基積雪草酸含量測定。

圖1 羥基積雪草酸對照品色譜圖

圖2 羥基積雪草酸納米粒色譜圖

3.2 Box?Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化MA-SLN處方

3.2.1 利用 Box?Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化 MA?SLN處方 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Design Expert 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，該軟件對數(shù)據(jù)分別進(jìn)行了線性、兩因素交互作用、完全二次多項(xiàng)式模型擬合，得出的最佳擬合模型其擬合方程如下：Y＝0.83?0.10 X1+0.014 X2+0.070X3+0.0075 X1X2-0.040 X1X3-0.015 X2X3+0.014對二項(xiàng)式方程中的各項(xiàng)系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果，表3。

由表3 結(jié)果可知，R2=0.9765，說明模擬程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，模型相關(guān)度良好。X1對包封率和載藥量有極顯著影響（P<0.01），X3對包封率和載藥量有顯著影響（P<0.05），交互項(xiàng)中X1X3對包封率和載藥量有顯著影響（P<0.05），二次項(xiàng)中X22、X32對包封率和載藥量也有顯著影響（P<0.05）。

表3 回歸方程顯著性檢驗(yàn)

3.2.2 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 應(yīng)用Design Expert 8.0實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，繪制處方各因素X1、X2和X3對響應(yīng)值Y的效應(yīng)曲面圖，結(jié)果（圖3）。根據(jù)Box?Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果。

圖3 Y與山崳酸甘油酯用量(X1)、P188與T-80用量比(X2)、藥物含量(X3)的響應(yīng)面圖

選出各因素的最佳取值范圍，得到各因素的最佳取值：山崳酸甘油酯 300 mg，P188 與 T?80 用量比為1∶1，羥基積雪草酸含量為230.87 mg。

按此最優(yōu)處方制備樣品（圖4）。在該條件下，樣品的平均載藥量為21.53%，平均包封率為84.09%，平均綜合評(píng)分為0.974，預(yù)測綜合評(píng)分為0.973，偏差0.1%，表明建立的數(shù)學(xué)模型較好，優(yōu)化工藝參數(shù)可靠。

圖4 羥基積雪草酸固體脂質(zhì)納米粒樣品

3.3 質(zhì)量評(píng)價(jià) 利用透射電鏡觀察MA?SLN的外觀形態(tài)，結(jié)果顯示納米粒為球形或類球形實(shí)心粒子，大小均勻，外觀圓整（圖5）。采用90 plus Zeta 電位粒徑分析儀測定納米粒的粒徑、粒度分布及Zeta電位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MA?SLN 的平均粒徑為（226.8±11.2）nm，PDI為（0.19±0.08），Zeta 電位為（?25.11±3.24）mV，粒徑分布范圍窄，呈正態(tài)分布（圖6,7）。

圖5 MA?SLN透射電鏡圖（×100000倍）

圖6 MA?SLN粒徑分布

圖7 MA?SLN Zeta電位

3.4 體外累積釋藥率測定結(jié)果 對按優(yōu)化處方制得的MA?SLN 樣品，進(jìn)行體外累積釋藥率測定，結(jié)果見圖8，擬合方程，表4。

表4 羥基積雪草酸累積釋藥擬合方程

圖8 羥基積雪草酸體外釋放累積釋放度曲線(n=3)

結(jié)果表明，MA?SLN 體外累積釋放在 8、12、24 h 分別是39.72%、53.16%和75.63%，符合一級(jí)模型。而羥基積雪草酸溶液劑，在4 h 時(shí)累積釋藥率為97.36%，藥物已基本釋放完全，說明MA?SLN 具有緩釋作用。

3.5 體外滲透試驗(yàn) 羥基積雪草酸溶液和羥基積雪草酸固體脂質(zhì)納米粒溶出量Qi 隨時(shí)間變化曲線和透皮動(dòng)力學(xué)方程參數(shù)分別見圖9和表5。

表5 羥基積雪草酸透皮動(dòng)力學(xué)方程及透皮參數(shù)

圖9 羥基積雪草酸經(jīng)皮Qi?t關(guān)系圖（n=3）

結(jié)果表明，MA?SLN 的經(jīng)皮穩(wěn)態(tài)滲透速率及24 h 累積滲透量均遠(yuǎn)高于羥基積雪草酸溶液1.6 倍，說明MA?SLN透皮性能有較大改善。

3.6 皮內(nèi)滯留量的測定 透皮試驗(yàn)結(jié)束后取出豬耳皮膚，去除表面殘留的試驗(yàn)制劑，將試驗(yàn)制劑沖洗干凈，濾紙吸水，將皮膚剪碎后置15 mL 離心管，加2 mL甲醇浸泡12 h，超聲離心，0.22μm有機(jī)系濾膜濾過，HPLC 測定，計(jì)算羥基積雪草酸皮膚滯留量，表6。

表6 羥基積雪草酸累積滲透量及皮內(nèi)滯留量（n=3)

結(jié)果表明，MA?SLN 因其固體脂質(zhì)結(jié)構(gòu)運(yùn)載羥基積雪草酸，透過皮膚角質(zhì)層而滯留于皮膚深層，滯留量是普通溶液劑的2倍，更有利于發(fā)揮療效。

4 討論

固體脂質(zhì)納米粒系將藥物包裹或夾嵌于類脂中而制備的固體膠粒給藥系統(tǒng)，可有效提高難溶性藥物的口服吸收生物利用度，是一種新型遞釋系統(tǒng)。羥基積雪草酸是積雪草有效成分中抑制瘢痕形成最強(qiáng)的化合物[5]，但因難溶于水等因素而限制應(yīng)用。本課題采用溶劑乳化揮發(fā)-高壓均質(zhì)法制備MA?SLN，其經(jīng)皮穩(wěn)態(tài)滲透速率和皮內(nèi)滯留量約是普通溶液劑的1.6 倍和2 倍，提示固體脂質(zhì)體是一種能有效促進(jìn)羥基積雪草酸經(jīng)皮滲透的載體。但是SLN并不適合于皮膚給藥，故本課組下一步將開展納米凝膠系統(tǒng)的研究，有望為增生性瘢痕的治療提供更好的用藥選擇。

包封率和載藥量是評(píng)價(jià)脂質(zhì)體制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)，測定方法包括葡聚糖凝膠柱色譜法、透析法和超速離心法等。本課題比較了超濾離心法和透析袋法對MA 吸附的影響。結(jié)果顯示，超濾離心法對納米粒吸附率為（26.9±5.9）%，是透析袋法（9.8±1.6）%的2.7 倍。因此，選擇透析袋法測定包封率和載藥量。

接收介質(zhì)的選擇，預(yù)實(shí)驗(yàn)曾試用過生理鹽水、PBS 緩沖液、20%乙醇的生理鹽水等。因羥基積雪草酸不溶于水，生理鹽水、PBS 緩沖液均不能形成漏槽條件。參照文獻(xiàn)方法[9]，選擇20%乙醇的PBS緩沖液（pH=7.4）能溶解羥基積雪草酸，且形成較好的漏槽條件。

離體透皮試驗(yàn)中皮膚的選擇要根據(jù)不同動(dòng)物皮膚滲透性。有研究表明[10-11]：豬、猴的皮膚滲透性與人皮膚相近，家兔、大鼠、豚鼠的皮膚滲透性比人皮膚大。因豬耳的皮膚容易得到，所以本文透皮介質(zhì)選擇了豬耳。