內質網應激所致細胞死亡與柯薩奇病毒B3病毒性心肌炎

鄭詩悅，劉文秀，王丹，趙德超

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院心血管內科，哈爾濱 150001)

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是導致兒童和青年人猝死的常見心血管急癥，主要病理表現為心肌局限性或彌漫性炎癥改變。多種病毒感染可引起VMC，包括腸道病毒、腺病毒、巨細胞病毒、細小病毒B19、皰疹病毒6等，其中柯薩奇病毒B3(coxsackievirus B3，CVB3)是最常見的感染源[1]。VMC的發病機制與CVB3感染后引起的細胞器損傷、心肌炎癥反應及心肌細胞死亡(凋亡、自噬、焦亡等)有關。

內質網作為細胞的重要細胞器，是腔蛋白、分泌蛋白以及膜蛋白合成和轉運的地方，也是細胞內Ca2+的儲存場所，并擁有參與細胞脂質合成的大部分生物合成酶，執行多種細胞功能[2]。細胞在病毒感染、缺血、pH值變化、毒物等作用下，內質網環境改變，導致錯誤折疊和未折疊的蛋白質積累，內質網通過未折疊蛋白反應(unfolded protein response，UPR)激活一系列信號通路，進入“內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)”狀態[3-4]。慢性持續ERS時，UPR會導致病理反應，使細胞死亡；但在急性情況下，UPR是一種生理反應通過維持細胞穩態確保細胞存活[5]。在外界環境刺激下，ERS的產生主要涉及 3個感受器調控的信號通路：PKR樣內質網激酶(PKR-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)、肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)和激活轉錄因子(activating transcription factor，ATF)6。這些信號通路共同作用，參與細胞的存活與死亡[6]。現就ERS所致細胞死亡在VMC中的作用及研究進展予以綜述。

1 CVB3概述

CVB3屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，其遺傳信息存儲在一個7.4 kb大小的小單鏈RNA中，該單鏈RNA編碼4個結構蛋白(VP1～4)和7個非結構蛋白(2A～2C和3A～3D)[7]。CVB3的結構蛋白和非結構蛋白在病毒的感染、自我復制和釋放中起至關重要的作用，結構蛋白構成病毒衣殼，使CVB3具有特異的抗原性；而非結構蛋白的作用是確保宿主細胞產生病毒RNA，促進細胞膜溶解，并將組裝好的CVB3釋放到細胞外[8]。

1.1結構蛋白與非結構蛋白 CVB3的結構蛋白VP1可破壞細胞內穩態、影響細胞周期。VP1蛋白可調節宿主細胞的細胞周期，促進病毒蛋白成功表達，增加病毒復制[9]。而其他結構蛋白VP2、VP3以及VP4的具體作用目前尚不清楚。CVB3非結構蛋白2A的主要作用是促進病毒感染宿主細胞，并產生應激顆粒，使CVB3逃逸宿主抗病毒反應，降低宿主免疫反應[10]。CVB3感染細胞后，與細胞膜上的受體結合，使其RNA進入細胞內，完成病毒復制及釋放的過程。目前尚不清楚這一過程所涉及的膜受體及CVB3與膜受體結合的蛋白。近年研究發現，非結構蛋白2B作為膜結合蛋白，可誘導感染的宿主細胞產生自噬和鈣穩態改變[8]。2B蛋白可以與內質網膜結合，影響內質網鈣穩態，進而誘導ERS產生，促進細胞死亡，參與VMC的發生發展[8]。

1.2非結構蛋白2B 2B蛋白作為CVB3的非結構蛋白，是一種由99個氨基酸組成的多肽。2B蛋白包含兩個疏水區域，一個疏水區域形成兩親水性的α-螺旋，另一個區域則形成一個完全的疏水螺旋，這兩個螺旋結構由一個短的莖環連接。2B蛋白的這個螺旋-環-螺旋結構可整合到膜結構(如高爾基體膜和內質網膜)上，其是形成跨膜孔的基礎[11]。這一結構特性可能是CVB3感染后產生VMC的一個病理基礎。de Jong等[12]的研究證實，高爾基體是2B蛋白的靶蛋白，CVB3通過形成CVB3-2B四聚體插入到高爾基體膜內，導致高爾基體膜不穩定，誘導膜體產生囊泡，并促進病毒體在囊泡中的復制，再釋放到細胞外。van Kuppeveld等[13]證實，2B蛋白可破壞內質網的鈣穩態，導致Ca2+外流。但CVB3感染后是否是通過2B蛋白導致心肌細胞凋亡誘發VMC以及病理機制中是否有ERS的參與尚不清楚。

2 ERS參與VMC的發病機制

多種致病因素(缺氧、病毒感染、內質網Ca2+耗竭等)可誘發ERS。CVB3在感染過程中誘發UPR，激活不同的信號通路，誘導ERS。ERS通過增加下游炎癥因子的表達，促進細胞死亡，進而加重CVB3誘導的心肌炎[14-15]。

2.1促進細胞凋亡 細胞凋亡與細胞壞死不同，凋亡是犧牲特定細胞以獲得更大機體利益的一種程序性細胞死亡，是一種高度調控的細胞死亡過程，屬于正常生理過程[16]。CVB3感染心肌細胞后通過磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路，調控Bcl-2樣蛋白11、胱天蛋白酶(caspase)、Bcl-2相關X蛋白的表達，誘導細胞凋亡，參與VMC發展[17]。

當ERS長期存在或嚴重時，可通過激活PERK、IRE1和ATF6三種ERS感受器誘導細胞凋亡。①第一條信號通路是通過PERK/ATF4介導，參與調控一些靶基因的表達，如C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)[18]。CHOP在ERS過程中與促凋亡蛋白的啟動子結合，誘導p53上調的凋亡調節因子表達；同時，CHOP還可誘導其他促凋亡蛋白(內質網氧化還原酶-1α、生長阻滯和DNA損傷誘生蛋白34、Bcl-2樣蛋白11等)表達，促進細胞凋亡[19]。②第二條信號通路受IRE1感受器調控。當ERS發生時，IRE1通過剪接X盒結合蛋白1促進細胞存活[20]。但在嚴重ERS時，IRE1與腫瘤壞死因子受體相關因子2和凋亡信號調節激酶1結合，激活c-Jun氨基端激酶誘導細胞凋亡[21-22]。③通過嵌入內質網膜的2型跨膜蛋白激酶——ATF6感受器調控的信號通路。ATF6可以從內質網運輸到高爾基體，并被切割成p50ATF6，與細胞核內的ERS反應元件的啟動子結合，誘導ERS相關基因(如葡萄糖調節蛋白78)表達，進而調節促細胞凋亡基因表達[23]。Nakanishi等[24]研究發現，在ERS過程中ATF6可以激活caspase-12，促進細胞凋亡。

CVB3感染心肌細胞后，PERK、ATF6和IRE1三種ERS感受器表達上調，其中IRE1上調最顯著[25]，提示ERS可能主要通過IRE1感受器影響CVB3感染誘導的心肌炎癥反應。而抑制IRE1可顯著減少心肌促炎癥細胞因子的產生，減輕VMC，其機制與抑制核因子κB活化有關[25]。表明干擾ERS感受器的表達可能成為VMC的新治療策略。研究發現，在CVB3感染的心肌細胞中可觀察到鈣黏素表達下調，而ERS相關蛋白(葡萄糖調節蛋白78、PERK、真核翻譯起始因子2α、ATF4、CHOP)表達上調[26]。鈣黏素作為一種鈣結合蛋白，可通過調節內質網中Ca2+的流動，影響心肌細胞的收縮與舒張。因此，增加鈣黏素的表達可以減少Ca2+外流，減輕ERS，抑制細胞凋亡，最終減輕VMC所致的心力衰竭，這可能成為治療VMC的有效靶點。Nie等[27]研究發現，CVB3感染心肌細胞后，ERS依賴的細胞內Ca2+超載可激活鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ，抑制ERS，從而間接使細胞內Ca2+積累減少，降低鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ活性，延緩VMC發展。綜上可知，CVB3感染后可促進ERS的產生，其主要通過影響內質網Ca2+流動及細胞內Ca2+變化，誘導心肌細胞凋亡，導致VMC的發生發展。因此干預ERS及ERS感受器的表達，減輕內質網Ca2+外流，抑制細胞內Ca2+超載，減輕心肌炎癥反應，可能成為治療VMC的一個潛在靶點。

2.2促進細胞自噬 自噬是維持細胞動態平衡的一種重要的進化保守機制，ERS與細胞自噬的激活密切相關。ERS誘導的細胞自噬主要包括內質網吞噬和ERS介導的自噬。內質網吞噬的相關信號通路涉及自噬相關基因(autophagy-related gene，Atg)40/內質網自噬標記蛋白，其過程為自噬小體選擇性地包裹并降解內質網膜，最終導致內質網吞噬。ERS介導的自噬是以產生自噬小體為特征，這些自噬小體包括破損的蛋白質、蛋白質聚集體和受損的細胞器，通過激活PERK、IRE1和ATF6三種ERS感受器誘導細胞自噬[28]。CVB3感染心肌細胞后可激活PERK、IRE1和ATF6三種ERS感受器，誘導心肌細胞自噬，促進VMC發展[29]。PI3K/mTOR信號通路參與了CVB3感染誘導的自噬過程，抑制PI3K和mTOR的功能可抑制CVB3復制，減少病毒蛋白的表達，從而抑制細胞自噬，減輕細胞炎癥反應[30]。研究表明，CVB3感染心肌細胞后可激活胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)，通過增加自噬小體的數量促進細胞自噬，加重心肌細胞損傷；而抑制ERK活性后自噬小體數量顯著減少[31]。提示CVB3誘導的自噬小體積累可能通過ERK途徑引發。Mohamud等[32]的研究發現，CVB3感染心肌細胞后還可誘導一種非典型自噬。這種自噬繞過了PI3K信號通路，最終匯聚到Atg5-Atg12-Atg16L1信號通路上，參與VMC的發生發展。可見，CVB3感染后可能通過上述信號通路直接或間接誘導心肌細胞自噬，這可能是VMC潛在的發病機制。當ERS嚴重時，ERS誘導的自噬和凋亡可相互串擾，它們之間存在共同的上游信號通路，包括PERK/ATF4、IRE1、ATF6等。自噬可通過降低caspase級聯反應抑制細胞凋亡，減輕細胞損傷；而caspase的激活可以降解自噬相關蛋白(Atg4、Atg3、Bcl-1等)，抑制細胞自噬[33]。因此，在ERS條件下，細胞自噬與凋亡通過共同的上游信號通路相互串擾，在VMC中發揮重要作用，但具體哪種途徑誘導的細胞死亡占主導作用有待進一步研究(圖1)。

PERK:PKR樣內質網激酶；IRE1:肌醇需求酶1；ATF:激活轉錄因子；eIF2α:真核翻譯起始因子2α；XBP:X盒結合蛋白；CHOP:C/EBP同源蛋白；GADD34:生長阻滯和DNA損傷誘生蛋白34；PUMA:p53上調的凋亡調節因子；ERO-1α:內質網氧化還原酶-1α；Bim:Bcl-2樣蛋白11；ASK1:凋亡信號調節激酶1；TRAF2:腫瘤壞死因子受體相關因子；JNK:c-Jun氨基端激酶；GRP78:葡萄糖調節蛋白78；caspase:胱天蛋白酶；ERS：內質網應激

2.3促進細胞焦亡 細胞焦亡是一種不同于凋亡和自噬的新型程序性細胞死亡方式。細胞焦亡是以細胞核和胞質凝聚為主要特征，激活caspase級聯反應，導致質膜破裂并釋放白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18等炎癥因子，引起細胞死亡[34]。越來越多的證據表明，細胞可通過caspase-4/5/11介導的非經典途徑和caspase-1介導的經典途徑(人caspase-4/5、小鼠caspase-11)誘導焦亡[35-37]。Yu等[38]發現，CVB3感染后小鼠心肌細胞的鈣蛋白酶被激活，并激活下游核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)、caspase-1和caspase-11，而抑制鈣蛋白酶可顯著抑制NLRP3、caspase-1和caspase-11的表達，減少細胞焦亡，減輕心肌細胞損傷及心臟炎癥，提高小鼠的存活率。因此，抑制鈣蛋白酶可抑制典型的NLRP3/caspase-1途徑和非典型的caspase-11途徑介導的細胞焦亡，減輕VMC，這為VMC的治療提供了新視角。

Wang等[39]還觀察到，CVB3感染后心肌細胞中的組織蛋白酶B(Cathepsin B，CatB)被顯著激活，NLRP3炎癥小體表達增加，產生細胞焦亡。基因消融CatB后可減少NLRP3炎癥小體的表達，減少炎癥細胞浸潤，顯著提高小鼠存活率，提示CatB可通過激活NLRP3，促進細胞焦亡，從而加重CVB3誘導的VMC[39]。CVB3感染海拉細胞后IL-18和NLRP3表達增加，caspase-1活化，引起細胞焦亡[40]。應用caspase-1抑制劑后，CVB3的復制率明顯降低，細胞焦亡被抑制，VMC減輕。由此可推測，抑制caspase-1可抑制下游NLRP3炎癥小體，從而抑制細胞焦亡，這一發現可能為VMC提供新的治療策略。研究表明，ERS是NLRP3炎癥小體激活的重要因素：ERS可通過調節鈣穩態、促進氧化應激等途徑激活NLRP3炎癥小體，促進下游炎癥因子IL-1β表達，進而誘導炎癥反應參與炎癥疾病[41]。但在VMC中，ERS與細胞焦亡的關系及其相關信號通路文獻報道較少，因此未來需要進一步研究以闡明ERS、細胞焦亡、VMC之間相互作用的潛在機制，以便設計新的藥物控制VMC中的ERS和炎癥反應。

2.4促進鐵死亡 鐵死亡不同于其他形式的細胞死亡，是一種鐵依賴的程序性細胞死亡。鐵死亡的主要機制為：在二價鐵或酯氧合酶的作用下催化細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，從而誘導細胞死亡，其特征是通過Fenton反應產生的活性氧類導致脂質過氧化。鐵死亡通過ERS途徑參與糖尿病的心肌缺血再灌注損傷。在糖尿病心肌缺血再灌注損傷過程中，抑制ERS可減少細胞鐵死亡，減輕心肌損傷[42]。具體機制可能為鐵離子與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶相互作用并產生活性氧類，觸發ERS，ERS與活性氧類相互作用誘發鐵死亡[42]。目前僅初步證實了鐵死亡的發生伴隨ATF4/CHOP通路的激活，誘導產生ERS，影響心肌細胞損傷，但是否也通過其他相關信號通路誘導產生ERS研究較少。另有研究發現，鐵死亡可與其他類型的細胞死亡(如凋亡)相互串擾[43]。凋亡和自噬已被證實參與了VMC的發病過程，因此推測鐵死亡也可能參與了VMC的發病過程。上面提到，PERK/ATF4通路介導的ERS參與了CHOP等多個靶基因的表達調控，誘導p53上調的凋亡調節因子、生長阻滯和DNA損傷誘生蛋白34、內質網氧化還原酶-1α、Bcl-2樣蛋白11等凋亡因子的表達，從而誘導細胞凋亡。研究顯示，鐵死亡也可誘導p53上調的凋亡調節因子表達，p53上調的凋亡調節因子在鐵死亡與細胞凋亡之間的串擾中起重要作用[44]。但有關鐵死亡是否參與了VMC的發病機制以及ERS誘導細胞鐵死亡涉及的信號通路研究較少。

3 小 結

雖然VMC的發病機制尚未明確，但很多研究提示ERS通過促進細胞死亡參與了VMC的發生發展。所以，有效干預并減輕ERS可能成為治療VMC的新方法。目前，有藥物(如苯丁酸鈉)通過抑制ERS減輕了細胞凋亡。苯丁酸鈉可用于治療與蛋白質錯誤折疊有關的疾病，減輕ERS，抑制細胞凋亡[45]，但苯丁酸鈉具體通過哪種信號通路抑制ERS，以及其在VMC中是否發揮作用尚未明確。另有文獻報道，褪黑素可通過調節細胞凋亡和自噬水平改善左心室功能，顯著減輕CVB3誘導的心肌炎[46]，但其是否通過ERS起作用仍有待進一步研究。此外，鐵死亡已成為研究的新熱點，已被證實與ERS相關，但其在VMC中起何種作用尚不清楚。CVB3的非結構蛋白2B可以與內質網膜結合，引起Ca2+外流，產生ERS，導致細胞死亡，從而參與VMC的發生發展，但2B蛋白通過哪些ERS感受器起作用尚未有研究證實。在VMC中，對ERS及其下游信號通路的深入研究可以進一步了解VMC的發病機制，但通過干擾CVB3 2B蛋白的合成或抑制2B蛋白與內質網膜結合可能會為VMC的治療提供新視角。