血液制品病毒安全性控制措施研究進展

黃進英

【摘要】文章主要是分析了血液制品染菌的危害，在此基礎上講解了細菌污染途徑及控制措施，最后探討了幾種有效能夠滅活病毒的方法，望可以為有關人員提供到一定的參考和幫助。

【關鍵詞】血液制品;病毒滅活;原理;安全性

【中圖分類號】R392-33 ? 【文獻標識碼】A 【DOI】10.12332/j.issn.2095-6525.2021.12.210

前言

血液制品主要是從一些健康的血液中通過分離、純化或由DNA重組技術所創新制備出來的白蛋白類、球蛋白類以及凝血因子類等，這些血液制品可以有效的在急救、疾病預防所需要用到的藥物上，血液制品的安全是人們共同關注的重要問題，為此如何有效的去除其中的病毒是科學人員應當不斷進行探索和解決的難點。

1 ?血液制品染菌的危害

血液制品污染引起的菌血癥最初是通過輸血并發癥來的。雖然菌血癥的發病率不高，但會導致嚴重的后果。據報道，1986年至1989年，美國共有7例患者因輸注細菌污染的血小板而死亡，盡管大多數液體血液制品在污染后可能出現明顯的生物膜、霉菌團和絲狀物，或液體渾濁、產生顆粒和氣體，這些都可以通過清晰度檢測出來，但對于那些單瓶凍干血液制品在分裝或凍干過程中，細菌感染后不易被檢出，對患者造成了一定的威脅。

2 ?細菌污染途徑及控制措施

細菌污染可能發生在整個血液制品的生產過程中。潛在的有害細菌通常來自原料或個人接觸受污染的產品。由于細菌污染途徑的多樣性，通常很難控制被污染的細菌。因此，為可以制備安全可靠的血液制品，至少應從原血漿、原材料和包裝過程的質量控制方面采取到了有效的控制措施。

2.1原料血漿污染

在血液收集和血漿分離過程中消毒效果不佳，血液收集前的消毒效果不佳，血液收集器和血漿容器的不完全消毒將直接影響原始血漿的質量。結果表明，主要污染細菌是G B細菌。在血液收集和血液捐贈的消毒作用和血漿中的污染細菌中檢測到細菌之間存在一定的關系。孤立的細菌主要是G B細菌。因此，在血液收集前嚴格的消毒和無菌操作是確保血漿無菌性的重要前提。按照世界衛生組織（1995年版）的規定，應以一種方式對血液供血的靜脈刺穿部位的皮膚，以確保血液收集是沒有細菌的。當血液按照無菌程序收集到容器中時，原料血漿的最大細菌計數應在投料前控制50cfu/ml。涂層分離應在無菌封閉的塑料袋系統中進行。防止分離血漿再次被細菌污染，應該在6小時內冷凍并儲存-25℃。

2.2原輔料的污染

因為多種原料和輔助材料如糖，酒精或一些化學試劑，輔料、包括生產水、可能導致由于微生物污染，原料和輔助材料如氨基酸和使用的含有副產品的細菌污染在靜脈內免疫球蛋白的制備中應計數細菌，并且在使用前應該消毒并過濾滅菌原料和過濾，并且應該進行消毒和過濾，每次進行常規細菌計數制定了原料和輔助材料，以及相應的許可和排斥限制標準。

2.3分裝過程的污染

為可以保證滅菌系統的安全性和無菌包裝質量的可靠性，在滅菌和過濾前應對濾膜的泡點進行檢測。無菌室的清潔是保證產品無菌質量的重要環節。FDA指出，保證產品質量的關鍵是在極高的環境質量條件下對產品進行包裝和密封。無菌室中的微生物含量不應超過25 CFU/10立方英尺是可以接受的。我國藥品生產管理標準中無菌室的無菌等級是萬級≤1cfu/平均。工人的頻繁活動導致灰塵附著的細菌污染產品。按照人們在無菌室中的人們的活動的粒子狀態，從靜態狀態產生到快速移動狀態的顆粒可以產生100000/min-3千萬/min。因此，分配人員應加強無菌概念和無菌手術技術，定期在分配人員手指上進行細菌文化，并為分配人員和血液產品建立一個系統。在儲存或運輸過程中，由于擠壓，容器損壞，因此，選擇高質量的儲存容器非常重要。

3 ?經血傳播的病原體

理論上，如果病毒感染時出現病毒血癥，則可能通過輸血和血液制品傳播。經確認的血源病毒包括HIV、甲型肝炎病毒、乙肝病毒、丙型肝炎病毒、D型肝炎病毒、E型肝炎病毒和G型肝炎病毒、輸血傳播病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、人T淋巴細胞白血病病毒、EB病毒、人類皰疹病毒-8、人細小病毒B19、西尼羅河病毒等。在采取有效的原始血漿篩查和病毒滅活/清除措施前，報告了HIV、HAV、HBV、HCV、HDV、HEV、HGV、TTV、B19等血液制品。突變病原體是一種只含一種蛋白質而不含核酸的病原體，目前還沒有證據表明它可以通過血液制品傳播，但近年來，又有一起疑似輸血感染凝血因子Ⅷ的病例報道。世界各國已經進行了更為準確的風險評估，尚不能排除這些風險。在生產血液產品的過程中，可以通過無菌過濾除去細菌，寄生蟲和其他病原體，這不會對血液產品的安全構成威脅。

4 ?獻漿員的遴選與病原體檢測

原料血漿的質量是保證血液制品安全的首要條件。經過幾十年的發展，世界各國已經形成了一套嚴格的血漿采集和供應體系。以美國為例，FDA從1973年開始對血漿采集和供應機構進行監督管理，通過質量保證、血漿捐獻者資格認證、臨床試驗認證、實驗室認證、藥物警戒等五大質量體系，建立了一套完整的管理體系和監測體系，血漿采集/處理、檢疫/儲存/處置系統包括血漿供體篩查、檢疫隔離、血漿檢測等五個安全環節，事故監測和調查有效保障了血漿采集的安全和原料血漿的質量。目前，血液產品僅由中國等離子交換收集的固定健康人血漿產生。從理論上講，風險很小。中國有超過100個血漿分離站，由各種血液制品企業進行操作和管理，并嚴格受到國家的監督。其管理系統和質量標準基本達到了歐洲和美國發達國家的水平。首先，有必要嚴格選擇血漿捐贈者，包括健康狀況，體檢和驗血。只有令人滿意的結果只能提供血漿。在血漿收集后，一系列病毒試驗應在單血漿上進行，并預先生產的混合血漿，以確保沒有病毒污染。各國都出臺了相關規定或指導方針，并嚴格對原漿病毒檢測、血漿篩查方法、僅進行血清學檢測，由于檢測靈敏度等局限性，病毒抗體在陽轉血漿樣本內潛伏期（窗口期）會產生不可避免的誤解，導致部分血液制品（如脆性凝血因子VIII）傳播血源病毒，因此自上世紀90年代以來，發達國家在加強病毒滅活/去除過程的同時，提高了核酸擴增檢測技術，提高了血液制品的檢測水平。在我國的藥典中，血液產品的血漿血漿應通過氨胺轉移酶，乙型肝炎表面抗原，HIV1/2抗體，HCV抗體檢測，NAT測試，歐洲藥物管理，單次失敗需要HBsAg，HIV1/2ARIBODIES，HCV抗體，HCSAG，HIV1/2抗體，HCVRNA，此外，病毒滅活的混合血漿增加了B19DNA和HAVRNA兩種測試項目，用于產生抗D免疫球蛋白混合血漿增加檢測B19DNA。按照美國藥品和食品管理局發布的指南，原料血漿應進行HBSAG、HiVRNA、HCV抗體和HCV RNA檢測，此外，FDA還建議生產商進行B19 DNA檢測，以確保血液制品的安全性，同時遵守相關法律法規，許多血液制品制造商都加入了國際血漿蛋白治療配方，并自愿對少量混合血漿進行檢測，如CSLBehring、Octopharma等公司自愿對少量混合血漿進行HiVRNA、HAVRNA、B19DNA檢測。

5 ?檢疫期管理

原料檢疫期的管理是指按照試驗結果提供的原料血漿生產的技術措施，并在單位血漿站提供的固結原料血漿的一段時間之后，以及再血漿的血漿樣品按照測試結果進行測試。國家食品和藥物管理局于2007年發布相關規定，規定原料血漿的檢疫期不低于90天，即收集和測試原料血漿體90天，合格的原料血漿只能在樣品的質粒血漿中進行測試和合格。2008年，進一步規定，如果血液制造商增加病毒核酸擴增檢測試劑以在酶聯免疫吸附測定的基礎上檢測血漿樣品，則每日起始時間限制不小于60天。歐洲和歐洲等發展國家美國使用NAT篩查病毒篩查原料血漿，從而縮短窗口，因此，制造商本身通常使用或確定60天結賬期。檢疫時間管理的管理原料血漿可以有效降低缺乏的風險在窗口期間檢查，這是能夠有效控制到了原料血漿的有效措施之一。

6 ?光化學病毒滅活方法

補骨脂素光化學法是使用其化學光敏性與致病微生物的核酸或蛋白質結合，并且在光的條件下發生光化學反應，使病原體滅活并且病毒不能復制，從而有效地滅活病毒在血漿中。病毒滅活方法可以有效地滅活大多數DNA病毒，RNA病毒，脂質涂覆的病毒和非脂質涂覆的病毒在血漿中，但對于光化學的抗性細小病毒而言是無效的。因為牛奶醛光化學方法對病毒核酸直接影響，但對血漿中的其他蛋白質成分幾乎沒有影響，它通常用于滅活血小板和凝血因子。亞甲藍是一種含正電荷的吩噻嗪衍生物，由Heinrich Caro于1876年首次合成。亞甲藍化學方法是利用theraflex亞甲藍血漿系統在輕量條件下形成單線氧或自由基，破壞原結構核酸對病原體進行殺菌，是我國唯一批準臨床應用的技術，而核化學病毒的核化學方法是近年來光volumy研究的熱點之一，它利用紫外光或可見光照射和氧化傳遞電子，仍在破壞核酸骨架以使病毒失活。該方法可以有效地滅活產物中的病原細菌，對蛋白質含量沒有明顯影響。核魚素是人體的必需維生素，照明后的代謝物與人體相同。因此，通過該方法制備的血液產品對人體造成較小。一方面，它會導致核酸的突變，阻礙核酸的復制和轉錄，并導致蛋白質合成的失敗;另一方面，自由基的生產引起光相化，導致細胞死亡和病毒失活。這種方法可以用于病毒在血小板中的滅活，但它們的失活時間影響血小板的質量，非活性時間越長，血小板損傷的變化越大，蛋白質濃度會影響滅活效果，蛋白質濃度越高的情況下會使得紫外線穿透力越弱，滅活效果越差。

7 ?病毒滅活/去除工藝

血液制品的病毒失活/去除過程是能夠有效的防止到了血液產品中血型病毒傳播的關鍵措施。各國監管機構發布的相關法規/指南是強制性文件，也是制造商關注的關鍵過程鏈接之一。2002年，國家食品和藥物管理局發布了血液制品排毒/失活的技術方法和驗證指南。顯然需要在生產過程中存在某種病毒去除/滅活能力，并且在生產過程中應該有特異性病毒去除/滅活方法。一種有效可靠的病毒滅活/去除方法通常要求病毒滴度≥4病毒滅活/去除后的日志，易于模擬和確認。對于工藝條件的變化，為可以最大限度地激活或去除原血漿中可能被污染的病毒，世衛組織要求在每種產品的生產過程中采用兩種或兩種以上的方法對病毒進行滅活或去除，才可以有效的確保到了產品的病毒安全。目前的失活技術包括熱處理（包括巴氏殺菌，干熱，蒸汽加熱），有機溶劑/表面活性劑（S/D）和低pH培養物。在1948年以來，巴氏殺菌已用于人血清白蛋白產品。到目前為止，已經證實了加工的人血清白蛋白作為無病毒產品，并已寫入世衛組織生物制品規定，但這種方法不適用于凝血因子產品的失活，低pH孵育方法僅適用于免疫球蛋白產品的滅活當中。解毒技術包括沉淀（低溫乙醇），色譜和納米過濾。低溫乙醇方法和色譜法都具有一定的解毒能力。單一應用不能完全保證病毒去除，并且需要添加其他特定病毒失活/去除方法。S/D方法首先報道于1985年，是病毒失活/去除方法的第一個飛躍，其被認為是消除包膜病毒的絕對有效的方法。1994年報道的納濾方法是病毒失活/去除方法的第二次飛躍。該方法解決了去除甲型肝炎，B19和其他小病毒的問題，但它不適合所有血液制品，并且使用成本相對較高，這限制了該方法的應用，并確保了血液產品的病毒安全性。

8 ?結束語

由上可知，血液制品滅活的方法、原理以及機制等都存在了一些不同，選擇科學合理的病毒滅活方法有著十分重要的意義。滅活病毒是一項艱巨的任務，為能夠有效確保到血液制品的安全性，科學人員應當在滅活病毒等方面繼續的努力前進。

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