元素分析-同位素質(zhì)譜測(cè)定蜂蜜中碳-4植物糖含量的能力驗(yàn)證結(jié)果與分析

謝金彤 張普霞 季美泉* 王栩璐 丁 濤 費(fèi)曉慶 王 艷 林 宏 鄧曉軍 伊雄海 韓 芳 謝 文 蔣沁婷

(1. 南京海關(guān)動(dòng)植食中心, 南京 210019; 2. 上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 上海 200002;3. 合肥海關(guān)技術(shù)中心, 合肥 230000; 4. 杭州海關(guān)技術(shù)中心，杭州 310000)

1 引 言

蜂蜜是蜜蜂采集花蜜釀造而成的。天然純正的蜂蜜具有優(yōu)越的口感、獨(dú)特的抗菌活性、具有較高的保健價(jià)值。隨著被更多人的喜愛(ài)與追捧，與其他高附加值的產(chǎn)品一樣，蜂蜜摻假現(xiàn)象也隨之增加。我國(guó)是蜂蜜生產(chǎn)大國(guó)、消費(fèi)大國(guó)和進(jìn)出口大國(guó)，蜂蜜摻假情況日益嚴(yán)重，蜂蜜的品質(zhì)和安全關(guān)乎民生。目前蜂蜜摻假鑒別方法主要薄層色譜法、碳-4植物糖含量測(cè)定法、液相色譜及其聯(lián)用技術(shù)、氣相色譜及其聯(lián)用技術(shù)、光譜法、核磁共振等[1-6]。而碳-4植物糖含量測(cè)定法是蜂蜜產(chǎn)品檢測(cè)中重要指標(biāo)，對(duì)于蜂蜜的收購(gòu)價(jià)格和銷售價(jià)格都有重要的影響。碳-4植物糖含量以蜂蜜中蛋白質(zhì)δ13C值為基準(zhǔn)，蜂蜜δ13C值與其進(jìn)行比較，根據(jù)GB/T 18932.1-2002《 蜂蜜中碳-4植物糖含量測(cè)定方法 穩(wěn)定碳同位素比率法》蜂蜜中碳-4植物糖含量的計(jì)算公式，得到蜂蜜中碳-4植物糖的含量[7]；當(dāng)計(jì)算結(jié)果含量大于7%時(shí)，被標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定該蜂蜜中摻有碳-4植物糖。

測(cè)定蜂蜜中碳-4植物糖含量使用的儀器為元素分析-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀，近年來(lái)該儀器在國(guó)內(nèi)檢測(cè)機(jī)構(gòu)、科研機(jī)構(gòu)中逐漸普及，絕大多數(shù)政府實(shí)驗(yàn)室、第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)，部分蜂蜜企業(yè)都擁有該儀器設(shè)備，具備開(kāi)展相關(guān)檢測(cè)工作的能力。為保證政府實(shí)驗(yàn)室，第三方檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室及企業(yè)蜂蜜質(zhì)量自控結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性，有必要在該領(lǐng)域開(kāi)展能力驗(yàn)證項(xiàng)目。

能力驗(yàn)證是分析判斷實(shí)驗(yàn)室綜合檢測(cè)能力的有效方式之一, 是通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)校準(zhǔn)/試驗(yàn)檢測(cè)能力或檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的綜合檢測(cè)能力[8,9]。能力驗(yàn)證計(jì)劃為實(shí)驗(yàn)室提供了一個(gè)通過(guò)評(píng)估和分析證明其檢測(cè)數(shù)據(jù)可靠性的客觀實(shí)驗(yàn)途徑。本研究設(shè)計(jì)組織蜂蜜中碳-4植物糖含量測(cè)定能力驗(yàn)證項(xiàng)目, 評(píng)價(jià)了來(lái)自 11個(gè)地區(qū)的 19家實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力和測(cè)定結(jié)果, 了解國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室在蜂蜜中碳-4植物糖含量檢測(cè)的整體水平，實(shí)驗(yàn)室間存在的差異的得到了基本的了解與掌握, 相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力得到了驗(yàn)證和強(qiáng)化，促使實(shí)驗(yàn)室保持和提高在同位素比值質(zhì)譜法檢測(cè)蜂蜜中碳-4植物糖含量方面的能力, 保障了蜂蜜的質(zhì)量安全, 也為政府食品質(zhì)量監(jiān)管部門(mén)提供了技術(shù)參考。

2 材料與方法

2.1 樣品制備

本次能力驗(yàn)證蜂蜜樣品從國(guó)內(nèi)某蜂蜜企業(yè)購(gòu)買，3種不同同位素?cái)?shù)值的蜂蜜，到實(shí)驗(yàn)室后利用攪拌機(jī)再次混勻。樣品使用塑料瓶包裝，每份樣品均在90g左右，常溫保存。樣品采用3份設(shè)計(jì)，其中考核樣1份為H，考核樣品H之間水平無(wú)差異，干擾樣2份為B1、B2。每個(gè)實(shí)驗(yàn)室將相應(yīng)地獲得2份樣品，包括1個(gè)考核樣品H和1個(gè)隨機(jī)的干擾樣品B。 在樣品分裝寄送時(shí)，隨機(jī)抽取，為保證樣品不出現(xiàn)交叉污染，分別在每個(gè)塑料瓶瓶口套上封口膜再套上塑料自封袋；為保證樣品在寄送過(guò)程中不出現(xiàn)擠壓導(dǎo)致破碎，在寄送紙盒內(nèi)放入泡沫塑料進(jìn)行減壓防震。

2.2 檢測(cè)方法

GB/T 18932.1-2002《蜂蜜中碳-4植物糖含量測(cè)定-穩(wěn)定碳同位素比率法》為本次能力驗(yàn)證水平測(cè)試的檢測(cè)方法中的推薦方法。需要檢測(cè)兩項(xiàng)指標(biāo)：蜂蜜的碳同位素比值δ13Ch和蜂蜜中蛋白質(zhì)的碳同位素比值δ13CP，根據(jù)這兩項(xiàng)參數(shù)計(jì)算蜂蜜碳-4植物糖含量。

2.3 儀器與試劑

本實(shí)驗(yàn)室采用的設(shè)備和試劑：

純水儀 ，提供超純水用來(lái)洗滌蜂蜜中蛋白質(zhì)、溶解蜂蜜。

臺(tái)式高速離心機(jī) XIR，用于蜂蜜樣品中的蛋白質(zhì)的離心。

穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀聯(lián)用儀EA-IRMS，用于測(cè)定蜂蜜δ13Ch值、蜂蜜中蛋白質(zhì)的δ13Cp值。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：IA-R00513C Beet Sugar(δ13C值為-26.03‰)。

錫杯5×3.5 mm；鎢酸鈉、硫酸(分析純)。

蜂蜜沉淀蛋白的沉淀劑：0.335 mol/L稀硫酸溶液和10﹪鎢酸鈉水溶液。

各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自身?xiàng)l件調(diào)整，各實(shí)驗(yàn)室采用的前處理方式、設(shè)備和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相關(guān)信息均需在結(jié)果報(bào)告單中詳細(xì)說(shuō)明。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法與結(jié)果評(píng)價(jià)

本次能力驗(yàn)證計(jì)劃中統(tǒng)計(jì)方案設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)方法按照《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》GB/T 28043-2011和CNAS-GL002：2018中相關(guān)要求規(guī)范進(jìn)行[10]。采用穩(wěn)健(Robust)中位統(tǒng)計(jì)技術(shù)處理作為結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析的方法，以減少極端值(即離群值)對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的影響。

其中，med為中位值,‰;NIQR為標(biāo)準(zhǔn)化四分位距;Z比分?jǐn)?shù)的大小代表實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果，X與指定值或中位值med的偏離程度，而符號(hào)“+”和“-”代表指定值或中位值med的偏離方向。

本次能力驗(yàn)證計(jì)劃項(xiàng)目以計(jì)算的Z比分?jǐn)?shù)來(lái)評(píng)價(jià)每個(gè)參加能力驗(yàn)證計(jì)劃實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力，即：

︱Z︱≤2為滿意結(jié)果；

2<︱Z︱<3為存有問(wèn)題的結(jié)果(可疑值)；

︱Z︱≥3為不滿意結(jié)果(離群值)。

3 結(jié)果與分析

3.1 參加的實(shí)驗(yàn)室情況

全國(guó)共有19家實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參加本次能力驗(yàn)證，包括15家政府實(shí)驗(yàn)室、3家第三方檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室和1家企業(yè)實(shí)驗(yàn)室覆蓋了11個(gè)省份。參加此次能力驗(yàn)證計(jì)劃的實(shí)驗(yàn)室的地域分布和數(shù)目見(jiàn)圖1。19家實(shí)驗(yàn)室均報(bào)告結(jié)果。

圖1 參加實(shí)驗(yàn)室地域分布情況

3.2 均勻性測(cè)定結(jié)果

考核樣品發(fā)給實(shí)驗(yàn)室前，按照《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》CNAS-GL003:2018的要求，采用單因子方差分析法，通過(guò)F檢驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，F(xiàn)值小于自由度為(f1，f2)及給定顯著性水平α(通常α=0.05)的臨界值Fα(f1，f2)時(shí)，認(rèn)為樣品是充分均勻的。本次能力驗(yàn)證考核樣品H的均勻性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，考核的樣品H的F值

表1 樣品中δ13Ch和δ13CP均勻性測(cè)試分析結(jié)果

參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)回收之后，用均勻性測(cè)試結(jié)果的考核樣品間標(biāo)準(zhǔn)差Ss除以參加實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)匯總統(tǒng)計(jì)得出的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ，以比值小于0.3為原則,Ss< 0.3σ確定考核樣品是均勻。本次能力驗(yàn)證的Ss< 0.3σ，表明考核的樣品H間無(wú)顯著性差異，考核樣品是均勻的,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中δ13Ch和δ13CP均勻性測(cè)試驗(yàn)證結(jié)果

3.3 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

使用標(biāo)準(zhǔn)CNAS-GL003:2018《能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南》，對(duì)考核樣品進(jìn)行極限溫度和儲(chǔ)存條件兩種類型的穩(wěn)定性試驗(yàn)。

首先是考察環(huán)境對(duì)樣品穩(wěn)定性的影響，模擬樣品的極限溫度運(yùn)輸條件下的穩(wěn)定性試驗(yàn)，針對(duì)不同溫度點(diǎn)不同的保存時(shí)間測(cè)試。分別把樣品存放在-18℃冰箱、4℃冰箱和37℃培養(yǎng)箱，樣品的穩(wěn)定性采用t檢驗(yàn)法評(píng)價(jià)，具體情況見(jiàn)表3。當(dāng)自由度為10，對(duì)應(yīng)的t臨界值t0.05(10)=2.23，計(jì)算得到的t值< t臨界值t0.05(10)，這表明在0.05顯著性水平時(shí)，樣品中的結(jié)果之間無(wú)顯著性差異，樣品的δ13Ch和δ13CP結(jié)果是穩(wěn)定的。

表3 環(huán)境對(duì)于樣品中δ13Ch和δ13CP穩(wěn)定性測(cè)試分析結(jié)果

另外，對(duì)考核樣品在貯存溫度下的穩(wěn)定性試驗(yàn)，以便于確認(rèn)考核樣品δ13Ch值和δ13CP值在能力驗(yàn)證計(jì)劃執(zhí)行周期內(nèi)是否穩(wěn)定，分別在第1天、第2天、第3天、第13天、第24天、第37天、第51天、第65天、第96天一共進(jìn)行9次能力驗(yàn)證穩(wěn)定性試驗(yàn)，采用t檢驗(yàn)法對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，本次能力驗(yàn)證樣品H的穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4 。當(dāng)自由度為10，對(duì)應(yīng)的t臨界值t0.05(10)=2.23，計(jì)算得到的t值< t臨界值t0.05(10)，這表明96天內(nèi)在0.05顯著性水平時(shí)，樣品中的結(jié)果之間無(wú)顯著性差異，樣品的δ13Ch和δ13CP結(jié)果是穩(wěn)定的。

表4 樣品中δ13Ch和δ13CP值穩(wěn)定性測(cè)試分析結(jié)果

3.4 總體能力驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)結(jié)果

本次能力驗(yàn)證參加實(shí)驗(yàn)室相應(yīng)地獲得了兩份樣品，包括1個(gè)考核樣品H和一個(gè)隨機(jī)的干擾樣品B(B包含B1、B2兩個(gè)不同同位素?cái)?shù)值樣品)，考核樣品H之間水平無(wú)差異。補(bǔ)測(cè)時(shí)，干擾樣替換成另一個(gè)樣。干擾樣不能被計(jì)入最后的結(jié)果統(tǒng)計(jì)和檢測(cè)能力評(píng)價(jià)中。共有19家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參與本次能力驗(yàn)證。本次能力驗(yàn)證計(jì)劃共發(fā)出樣品19組，共有19家實(shí)驗(yàn)室報(bào)告了有效結(jié)果，通過(guò)對(duì)報(bào)告結(jié)果進(jìn)行的統(tǒng)計(jì)分析，包括即結(jié)果總數(shù)(N)、中位值(med)、標(biāo)準(zhǔn)化四分位距(NIQR)、穩(wěn)健變異系數(shù)(Robust CV)、極小值(Min)、極大值(Max)等，詳情見(jiàn)表5。

表5 主要穩(wěn)健參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(樣品H)

3.5 結(jié)果評(píng)價(jià)

采用柱狀圖表示有關(guān)的統(tǒng)計(jì)量，更加直觀地了解本次能力驗(yàn)證活動(dòng)參加實(shí)驗(yàn)室的情況，的結(jié)詳見(jiàn)圖2和圖3。實(shí)驗(yàn)室的唯一識(shí)別代碼標(biāo)注在對(duì)應(yīng)的柱形圖旁，柱形圖是按其Z值的大小順序排列的。

圖2 H樣品δ13Ch的Z比分?jǐn)?shù)柱狀圖

圖3 H樣品δ13Cp的Z比分?jǐn)?shù)柱狀圖

本次能力驗(yàn)證初測(cè)結(jié)果的19家實(shí)驗(yàn)室中，結(jié)果滿意的實(shí)驗(yàn)室共15家，占實(shí)驗(yàn)室總數(shù)的 78.9%；結(jié)果可疑的共3家，占實(shí)驗(yàn)室總數(shù)的15.8 %；結(jié)果離群的有1家，占實(shí)驗(yàn)室總數(shù)的5.3%。檢測(cè)結(jié)果的總體情況見(jiàn)表6 。

表6 各實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證結(jié)果

說(shuō)明參加本次能力驗(yàn)證的絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室可以準(zhǔn)確的檢測(cè)蜂蜜中碳-4植物糖含量，具有較高的檢測(cè)水平。考核中結(jié)果可疑或離群的，主要是由于未按檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的要求進(jìn)行樣品前處理、儀器設(shè)備未能調(diào)試至最佳狀態(tài)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用不恰當(dāng)?shù)仍蛞鸬摹?/p>

3.6 技術(shù)分析與建議

3.6.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的影響

在碳同位素檢測(cè)過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的正確使用對(duì)于檢測(cè)準(zhǔn)確性是至關(guān)重要的。本次能力驗(yàn)證參加的實(shí)驗(yàn)室中6家使用咖啡因IAEA-600，數(shù)值：-27.771±0.043‰；2家使用甜菜糖 IA-R005，數(shù)值：(‰)26.03±0.11‰；5家使用橄欖油 CatNoB2172 ，數(shù)值：(‰)29.32±0.15‰；1家使用RM8542 ，數(shù)值：(‰)10.45±0.07‰；1家使用IVA33802174 ，數(shù)值：-37.32±0.04‰。其余幾家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)值均在-28.06‰至-26.39‰之間。由于檢測(cè)時(shí)需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，所以選擇與考核樣碳同位素比值相接近的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)就顯得尤為重要。考核樣的碳同位素?cái)?shù)值δ13Ch和δ13CP分別為-23.81‰和-24.72‰，其中兩家實(shí)驗(yàn)室所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)碳同位素?cái)?shù)值為-10.45±0.07‰和-37.32±0.04‰與考核樣的碳同位素?cái)?shù)值相差較大，實(shí)際使用的實(shí)驗(yàn)室所報(bào)考核樣結(jié)果也為可疑結(jié)果。建議實(shí)驗(yàn)室應(yīng)確保所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的碳同位素?cái)?shù)值與所檢測(cè)樣品碳同位素?cái)?shù)值相接近。

3.6.2對(duì)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)的理解

本次能力驗(yàn)證中大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室能夠正確的理解作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，也有少部分做的不到位的現(xiàn)象，比如結(jié)果有效數(shù)字位數(shù)、樣品標(biāo)識(shí)的填寫(xiě)等方面。建議實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)對(duì)于作業(yè)指導(dǎo)書(shū)內(nèi)容的解讀及能力驗(yàn)證相關(guān)人員的培訓(xùn)。

3.6.3儀器設(shè)備的影響

本次能力驗(yàn)證參加實(shí)驗(yàn)室中，5家使用的設(shè)備沒(méi)有使用參考?xì)猓?4家使用的設(shè)備有參考，而使用了參考?xì)獾膶?shí)驗(yàn)室結(jié)果滿意率為92.8%，未使用參考?xì)獾膶?shí)驗(yàn)室結(jié)果滿意率為40% 。由于同位素檢測(cè)過(guò)程存在偶發(fā)性，使用穩(wěn)定的參考?xì)庾鳛槎ㄖ档膮⒄沼葹橹匾?/p>

3.6.4檢測(cè)過(guò)程的質(zhì)量控制及對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的理解

參加本次計(jì)劃的實(shí)驗(yàn)室均聲稱嚴(yán)格按照《蜂蜜中碳-4植物糖含量測(cè)定-穩(wěn)定碳同位素比率法》GB/T 18932.1-2002的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。該方法需要對(duì)樣品進(jìn)行兩步處理，第一部分用于測(cè)定蜂蜜的碳同位素比值δ13Ch，第二部分用于提取蛋白質(zhì)測(cè)定蜂蜜蛋白質(zhì)的碳同位素比值δ13CP。蜂蜜稱取前需要搖勻，防止結(jié)晶影響檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)蜂蜜中花粉含量過(guò)高時(shí)，需要除去花粉，減少其對(duì)δ13Ch測(cè)定的影響。很多時(shí)候δ13Ch測(cè)不準(zhǔn)就是這個(gè)原因?qū)е隆Ｔ诘鞍滋崛『螅绻鞍踪|(zhì)中的糖未能用水洗滌充分將會(huì)導(dǎo)致δ13CP結(jié)果偏向δ13Ch；進(jìn)樣時(shí)所取的蛋白測(cè)試樣不均勻，可能會(huì)取到更多的花粉，使得δ13CP結(jié)果遠(yuǎn)離δ13Ch一方，可能造成假陽(yáng)性。所以要理解標(biāo)準(zhǔn)文本中每一個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟的目的，省察每個(gè)步驟的完成情況，來(lái)確保樣品在進(jìn)入設(shè)備分析前是均勻且可信的。

4 結(jié) 論

在本次能力驗(yàn)證參加的實(shí)驗(yàn)室有近一半都是沒(méi)有或較少有蜂蜜中碳-4植物糖含量檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)的。絕大部分實(shí)驗(yàn)室結(jié)果都是滿意的，少數(shù)實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)不滿意或有問(wèn)題結(jié)果的情況需要后期對(duì)照糾正。希望通過(guò)此次能力驗(yàn)證，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室間溝通，提高全國(guó)不同系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室利用同位素比值方法對(duì)蜂蜜中碳-4植物糖含量檢測(cè)的整體水平。