UPLC-MS/MS測(cè)定化妝品中63種激素類(lèi)組分

呂瓊芳 彭 敏 梁惠明 黃少宏 杜 瓦

(江門(mén)市藥品檢驗(yàn)所， 江門(mén) 529000)

化妝品已經(jīng)成為人們生活中的必備品。但近年來(lái)質(zhì)量與安全問(wèn)題日趨嚴(yán)重，曾報(bào)道在化妝品中有添加重金屬、防腐劑、著色劑、激素等有毒禁用物質(zhì)[1，2]。從近些年國(guó)家藥品監(jiān)督管理局門(mén)戶(hù)網(wǎng)站發(fā)布的不合格化妝品通告中看到，在面膜、美白/祛斑、祛痘/抗粉刺類(lèi)化妝品中往往易存在激素非法添加情況，嚴(yán)重危害著消費(fèi)者的健康。激素按藥理作用可分為性激素和糖皮質(zhì)激素。性激素具有快速促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)、豐乳、美白、除皺和增加皮膚彈性等功能；糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物外用可降低毛細(xì)血管的通透性、減少滲出和細(xì)胞浸潤(rùn)，具有抗炎、抗過(guò)敏、免疫抑制、抗增生等作用，制成的膏霜外用后，粉刺、膿包、黑色素等能快速消失，面部更加白皙紅潤(rùn)。因此，不法化妝品生產(chǎn)者從中看到商機(jī)，在化妝品中濫用激素等禁用物質(zhì)。一旦使用激素，皮膚狀況就會(huì)越來(lái)越差。長(zhǎng)期使用會(huì)造成激素蓄積中毒，甚至產(chǎn)生皮膚角質(zhì)層變薄、紅血絲、怕光、長(zhǎng)毛等嚴(yán)重影響健康和美觀的后果，最終形成激素依賴(lài)性皮炎，進(jìn)而導(dǎo)致代謝紊亂甚至癌癥[3]。

我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)將63種激素類(lèi)成分列為化妝品禁用組分。化妝品基質(zhì)復(fù)雜，成分多樣，非法添加組分痕量，為樣品的前處理及檢測(cè)技術(shù)帶來(lái)很大的挑戰(zhàn)。而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)因具有靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、專(zhuān)屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，在定性要求高的禁用組分定量及確證方面逐漸成為主流技術(shù)[4-6]，隨著科技的發(fā)展，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)在化妝品中激素類(lèi)物質(zhì)非法添加的高通量篩查方面凸顯明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)依據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)中納入的新方法《化妝品中激素類(lèi)成分的檢測(cè)通用方法》，結(jié)合具體儀器及實(shí)際應(yīng)用，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定化妝品中63種激素類(lèi)組分的優(yōu)化方法，可用于化妝品中激素63組分非法添加的快速篩查及準(zhǔn)確定量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC H-Class Plus__XEVO TQ-S micro超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀； METTLER XS205DU電子分析天平 ；KQ-700DA型數(shù)控超聲波清洗器；Vortex3000渦旋振蕩器； CT15RT高速冷凍離心機(jī)；Milli-Q純水儀。

63種激素標(biāo)準(zhǔn)品：異氟潑尼松、氫化可的松、甲基潑尼松龍、地塞米松、地索奈德、氟氫縮松、鹵美他松、睪酮、布地奈德、孕三烯酮、甲基睪丸酮、曲安奈德醋酸酯、氯替潑諾、安西奈德、鹵倍他索丙酸酯、氯倍他索丙酸酯、氟替卡松丙酸酯、倍氯米松雙丙酸酯、雙氟可龍戊酸酯、環(huán)索奈德、雌酮、氟尼縮松、氟輕松、阿氯米松雙丙酸酯、莫米他松糠酸酯購(gòu)自公司，余下購(gòu)自某研究院，63種激素名稱(chēng)見(jiàn)表2；甲醇、乙腈 (質(zhì)譜純)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(符合GB/T 6682-2008一級(jí)水要求)。

表1 流動(dòng)相比例

表2 63種激素

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1儀器條件

色譜條件:色譜柱Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱(2.0mm×150mm，2.2μm)；流動(dòng)相：水(A)和乙腈(B)梯度洗脫，見(jiàn)表1。流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為 10μL，柱溫：40℃。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源 (ESI源)；離子化模式：ESI+和ESI-同時(shí)監(jiān)測(cè)；掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式; ES+模式毛細(xì)管電壓：3.5kV；ES-模式毛細(xì)管電壓：3.0kV；其余參數(shù)正負(fù)模式均相同：離子源溫度：150℃，脫溶劑氣溫度：600℃，脫溶劑氣流速1100L/Hr，錐孔氣流速：50L/Hr。0～7min：不進(jìn)入質(zhì)譜儀分析；7～30min：進(jìn)入質(zhì)譜儀分析。

1.2.2混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

稱(chēng)取63種激素標(biāo)準(zhǔn)品10mg(精確到0.00001g)，分別置于10mL量瓶中(其中曲安西龍、潑尼松、異氟潑尼松標(biāo)準(zhǔn)品稍難溶，將其分別置于25mL量瓶中)，加乙腈超聲使溶解并定容至刻度，搖勻。依次從各10mL量瓶中移取1mL，各25mL量瓶中移取2.5mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混合至同一100mL量瓶中，加50%乙腈溶液定容至刻度，搖勻，即得濃度為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.3樣品前處理

稱(chēng)取樣品0.2g(精確到0.001g)，置于10mL離心管中，加入少量乙腈，在渦旋混合儀上振蕩30s至試樣與提取溶劑混合均勻，然后加入乙腈至近刻度，超聲提取20min，靜置至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，以5000r/min離心10min，濾過(guò)，濾液作為待測(cè)溶液。如遇部分樣品待測(cè)液中激素含量超出標(biāo)曲上限，需要采用50%乙腈溶液稀釋至標(biāo)曲范圍內(nèi)再進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.4系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取與待測(cè)樣品基質(zhì)類(lèi)型相同空白樣品6份于10mL離心管中(0.2g/份)，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液80μL、160μL、400μL、800μL、1.6mL、2.4 mL，按照“1.2.3樣品前處理”的操作步驟處理，濾過(guò)。取濾液適量250μL置10mL量瓶中，再用50%乙腈溶液稀釋定容至刻度，配制成濃度為2、4、10、20、40、60ng/mL系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，待分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)中納入的新方法《化妝品中激素類(lèi)成分的檢測(cè)方法》為通用方法，試驗(yàn)過(guò)程中，個(gè)別組分的定性、定量離子對(duì)及碰撞能等監(jiān)測(cè)參數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)會(huì)有所差異，需要實(shí)驗(yàn)室根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化質(zhì)譜條件。將前59種采用正離子監(jiān)測(cè)模式的標(biāo)準(zhǔn)品單標(biāo)溶液(濃度1mg/mL)用50%乙腈溶液分別稀釋配制成濃度為300ng/mL的單標(biāo)調(diào)諧液，雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚4個(gè)采用負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式的標(biāo)準(zhǔn)品因響應(yīng)較弱，分別用50%乙腈溶液稀釋配制成濃度為1μg/mL的單標(biāo)調(diào)諧液。經(jīng)蠕動(dòng)泵分別注入離子源，采用流動(dòng)相和調(diào)諧液結(jié)合的模式進(jìn)行全掃描，依次優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、去溶劑氣溫度及流速、錐孔氣流速、使目標(biāo)化合物的響應(yīng)最大。確定母離子及調(diào)諧參數(shù)后，采用子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，篩選出至少2個(gè)子離子(響應(yīng)較高子離子作為定量離子，響應(yīng)較低的離子作為定性離子)，繼續(xù)優(yōu)化每個(gè)子離子的碰撞能，使待測(cè)物的離子化效率達(dá)到最佳。由于目標(biāo)組分多且正負(fù)源同時(shí)監(jiān)測(cè)，數(shù)據(jù)采集時(shí)采用設(shè)置時(shí)間窗口分段掃描方式來(lái)提高響應(yīng)靈敏度。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱選擇

在63種待測(cè)組分中存在較多的同分異構(gòu)體：地塞米松和倍他米松；地塞米松醋酸酯和倍他米松醋酸酯；氟尼縮松和曲安奈德；倍氯米松雙丙酸酯、阿氯米松雙丙酸酯和莫米他松糠酸酯。這些組分保留時(shí)間較為接近，母離子相同且產(chǎn)生離子對(duì)有交叉，給分離造成較大困難。實(shí)驗(yàn)嘗試多根不同廠家、不同粒徑、不同長(zhǎng)度的色譜柱，發(fā)現(xiàn)選用Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱(2.0mm×150mm，2.2μm)色譜柱，按照“1.2.1”優(yōu)化的色譜洗脫條件，各組分均能夠基本分離。

2.2.2洗脫條件優(yōu)化

按照通用標(biāo)準(zhǔn)中的流動(dòng)相洗脫程序分析時(shí)，更換不同色譜柱，地塞米松與倍他米松(地塞米松與倍他米松所有離子均相同)、氟尼縮松和曲安奈德峰間難以同時(shí)達(dá)到較好分離。在確定Shim-pack XR-ODS Ⅲ(2.0mm×150mm，2.2μm)色譜柱后，嘗試逐步優(yōu)化洗脫條，最終采用“1.2.1儀器條件”中所列的色譜條件，各組分峰的分離度及峰形均較佳(見(jiàn)圖1)。為減少基質(zhì)對(duì)色譜柱的污染及分析物的殘留，在梯度中間增設(shè)一段高比例有機(jī)相沖柱程序。

圖1 63組分標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.3 多峰定位

分析中遇到較多譜圖同時(shí)出現(xiàn)2～3個(gè)峰(見(jiàn)圖1)。布地奈德(通道30)物質(zhì)本為雙峰，選其中較大峰定量。在地塞米松(通道15)和倍他米松(通道16)、地塞米松醋酸酯(通道33)和倍他米松醋酸酯(通道34)、氟尼縮松(通道35)和曲安奈德(通道32)的色譜圖中，均出現(xiàn)另一組分色譜峰，進(jìn)行峰定位確定倍他米松在前，地塞米松在后；倍他米松醋酸酯在前，地塞米松醋酸酯在后；曲安奈德在前，氟尼縮松在后。在倍氯米松雙丙酸酯(通道57)、阿氯米松雙丙酸酯(通道58)和莫米他松糠酸酯(通道56)的色譜圖中，均出現(xiàn)另兩個(gè)組分的色譜峰，進(jìn)樣其中兩個(gè)單標(biāo)物質(zhì)定位，確定出峰順序依次為阿氯米松雙丙酸酯、莫米他松糠酸酯和倍氯米松雙丙酸酯。

2.4 基質(zhì)標(biāo)曲設(shè)計(jì)的優(yōu)化

在基質(zhì)標(biāo)曲試驗(yàn)中，直接加入混合標(biāo)準(zhǔn)液適量按前處理步驟得到終濃度 2、4、10、20、40、60ng/mL系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣峰形均很差甚至裂峰。改用先加入高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量用乙腈照“1.2.3 樣品前處理”進(jìn)行樣品處理，取上清液過(guò)濾后進(jìn)一步用50%乙腈溶液稀釋至上述終濃度，進(jìn)樣峰形明顯改善。續(xù)濾液用50%乙腈稀釋20倍，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后久置部分有絮狀物析出，按“1.2.4 系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備”中方法將續(xù)濾液稀釋40倍過(guò)濾后分析期間基本無(wú)絮狀物析出。采用50%乙腈水對(duì)樣品溶液進(jìn)行適量稀釋?zhuān)诓挥绊懘郎y(cè)成分回收率的情況下，可使部分雜質(zhì)析出后濾除，能夠起到保護(hù)色譜柱，減少基質(zhì)干擾，改善峰形，降低雜質(zhì)對(duì)質(zhì)譜響應(yīng)的影響作用。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線(xiàn)性關(guān)系、檢出限和定量限

取濃度為2、4、10、20、40、60ng/mL的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)樣，記錄定量離子對(duì)色譜峰面積并繪制峰面積和濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。63組分的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)均大于0.99。取濃度最低點(diǎn)稀釋成適當(dāng)濃度進(jìn)樣，信噪比均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的定量限及檢出限要求。

2.5.2加標(biāo)回收率試驗(yàn)

稱(chēng)取0.2g(精確到0.001g)同一基質(zhì)的樣品共9份，每組3份，置于10mL離心管中，加入濃度為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，按照“1.2.3樣品前處理”的操作步驟處理，濾過(guò)，取濾液適量，用50%乙腈溶液稀釋40倍制成濃度2ng/mL、20 ng/mL、60 ng/mL的低、中、高3個(gè)濃度的回收率試驗(yàn)溶液，測(cè)定63組分在這3個(gè)濃度的回收率。定量下限濃度的平均回收率為73.7%～106.3%，相對(duì)偏差小于12%，其他濃度回收率為90.8%～118.6%，相對(duì)偏差小于6%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.5.3精密度試驗(yàn)

取基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的低濃度和高濃度點(diǎn)，采用確認(rèn)的方法，每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算各個(gè)濃度級(jí)別的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，低濃度偏RSD均小于10%(標(biāo)準(zhǔn)要求≤15%)。高濃度偏RSD均不大于5%(標(biāo)準(zhǔn)要求≤5%)。

2.6 樣品的測(cè)定

采用上述分析方法，選取市售的膏霜、液態(tài)水基、面膜3種不同類(lèi)別的樣品各1批次進(jìn)行測(cè)定，在樣品中均未檢出63種目標(biāo)分析物。

3 結(jié)論

本研究在通用方法基礎(chǔ)上結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際利用UPLC-MS/MS進(jìn)行激素63組分測(cè)定方法的優(yōu)化，可為其他實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用此方法提供經(jīng)驗(yàn)參考，促進(jìn)新方法在基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。建立的優(yōu)化的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、線(xiàn)性關(guān)系良好。在保持儀器、色譜條件、質(zhì)譜測(cè)定參數(shù)等分析條件固定情況下，可用于化妝品激素63組分非法添加的快速篩查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)可疑樣品。為化妝品的檢驗(yàn)工作和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供有效的技術(shù)支撐，有利于凈化化妝品質(zhì)量市場(chǎng)，保障消費(fèi)者身心健康。