兔口腔鱗狀細胞癌的臨床診斷

范志宇，陳萌萌，仇汝龍，胡 波，魏后軍，宋艷華，朱偉峰，徐為中，薛家賓，王 芳

(江蘇省農業科學院獸醫研究所 農業部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室，江蘇 南京 210014)

2018年，安徽某兔場不間斷發現死亡毛兔口腔中有增生物、個體消瘦、顏面變形等情況。本試驗對臨床患病兔進行剖檢，通過病理組織石蠟切片方法，對兔口腔增生物進行病理學檢查，并進行了乳頭瘤病毒的檢測。綜合剖檢、病理切片和病原檢測結果，最終診斷病兔患口腔鱗狀細胞癌。本試驗首次報道了家兔口腔鱗狀細胞癌，為相關疾病的診斷和研究提供了科學依據。

1 疾病調查

通過問詢家兔養殖場場主及養殖人員得知，在本養殖場及周邊5個兔養殖場均出現口腔腫瘤發病情況，發病兔均為毛兔，暫未發現有肉兔和獺兔發生該病，并且該病集中發生于兔毛長且有卷曲的毛兔，發病率在20%以上，相同養毛期內兔毛短而直的毛兔未見發病。患病毛兔年齡偏大，均為2歲以上。

2 臨床癥狀

通過問詢得知，當發現毛兔出現口腔問題時，腫瘤已經相對較大，患病兔出現面部變形，精神沉郁，體溫正常，口腔增生物嚴重影響動物正常采食，采食量減少，吞咽困難，流涎，食欲減退，體重減輕，逐漸消瘦衰竭死亡。

3 大體剖檢病變

對瀕死的患兔安樂死后剖檢，結果顯示，患兔發育完全，體形偏瘦；天然孔(口、鼻、肛門)黏膜呈粉紅色，毛細血管充盈時間正常；口腔增生物呈浸潤性生長致使面部腫脹、變形，口腔內部皮膚多有壞死與出血；觸診增生物質地較硬，有結締組織將其分為多葉，最大的大小為2.5 cm×2 cm×1 cm，切面灰白色。經仔細檢查，頭部及身體其他部位未發現增生物。

4 病原檢測

設計PCR引物擴增不同的乳頭瘤病毒DNA片段，E3-F:5′-ATGATAGGCAGAACTCCTAAG-3′和E3-R：5′-CAGTTACAACACTCCGGGCAC-3′，擴增病毒基因片段E3，大小為 285 bp；E4-F:5′-ATGAGCCATGGACATTGC-3′和E4-R：5′-TTATAAGCTCGCGAAG-CC-3′，擴增病毒基因片段E4，大小為639 bp；E5-F：5′-ATGGGCTTTAGTGACGTGTA-3′和E5-R：5′-CTA-GTCGACCCCCAGAACC-3′，擴增病毒基因片段E5，大小為639 bp；P-450-F:5′-CTGGCAGAGCGCTTTG-GACCG-3′和450-R:5′-CTTGTCCTTAAACTCCCGCAAAG-3′，擴增兔細胞色素P-450，大小為159 bp，作為有效擴增的對照。反應體系：10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，上下游引物各(10 μmol/L)1 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，抽提物5 μL，加水補至25 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min，然后進行32次循環(94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s)，72 ℃ 5 min，4 ℃保溫。

提取增生組織RNA，反轉錄為cDNA，以此為模板，利用針對乳頭瘤病毒的特異性引物進行PCR擴增后，經過瓊脂糖凝膠電泳，結果為陰性(圖1)，結合臨床初步判斷該病不是乳頭瘤病毒感染所致。

圖1 PCR擴增乳頭瘤病毒不同DNA片段M：DNA marker(DL 2 000)；1～4:以增生物活檢DNA 為模板分別擴增病毒核酸E3、E4、E5和兔細胞色素P450；5～8：以乳頭瘤病毒DNA為模板分別擴增病毒E3、E4、E5和兔細胞色素P450

5 病理切片觀察

對患病家兔耳緣靜脈注射空氣安樂死后，在兔口腔患部進行手術去除增生物，觀察其形態，并取增生物進行常規病理組織學制片，石蠟包埋,切片厚 5 μm，H.E.染色，采集數碼圖像。結果顯示，該增生物為鱗狀細胞癌，癌組織浸潤性生長，形成大小不等，形狀不同的癌細胞團塊，即癌巢，較大的癌巢中心部分發生角化，即癌珠；腫瘤細胞形態和組織結構出現明顯異型性，即瘤細胞排列紊亂，瘤細胞及其核呈多形性。病變中可見少量明顯的角化不全性角質囊腫(中插彩版圖2A黃色箭頭)；也可見未非角化型鱗狀細胞癌小葉，周圍上皮細胞呈柵欄狀排列(中插彩版圖2B黑色箭頭)，中央呈透明細胞表現(中插彩版圖2B紅色箭頭)；可見嗜堿性核內包涵體。

圖2 兔口腔腫瘤H.E.染色切片觀察 (200 ×)A：角化型鱗狀細胞癌小葉；黃色箭頭：癌巢中可見少量角質化不全性角質囊腫；B：非角化型鱗狀細胞癌小葉；黑色箭頭：周圍上皮細胞呈柵欄狀排列；紅色箭頭：癌小葉中央呈透明細胞表現

6 討論

口腔腫瘤即為口腔頜面部腫瘤，有惡性和良性之分[1]。最常見的口腔惡性腫瘤為鱗狀上皮細胞癌，占口腔惡性腫瘤的90%，其作為全身惡性腫瘤中常見的腫瘤類型，不僅會造成面部畸形，同時也由于腫瘤位置的血液循環以及淋巴回流豐富，因此具有較高的轉移率[2-3]。在犬貓臨床中口腔腫瘤發生的概率較高，占所有腫瘤的6%[4-6]。

隨著家兔養殖技術的發展，一些品種的家兔(如：曾祖代或祖代種兔、毛兔、寵物兔等)飼養時間也逐步延長，可能發生與其他動物類似的腫瘤疾病的概率相對增加。研究顯示，家兔腫瘤疾病發病率為0.5%～2.7%，常見的家兔腫瘤包括子宮腺癌、乳腺腫瘤和皮膚瘤等[7]，口腔腫瘤也有被報道，但發病率似乎較低，多為病毒感染引起的良性腫瘤[1,8-9]，國內外尚未見關于兔惡性口腔腫瘤-鱗狀細胞癌的報道[7,10-12]。家兔腫瘤的發病率受年齡因素的影響很大，由于絕大多數商品兔和實驗兔都是在2歲以前就被利用，處于老年期的家兔才是腫瘤的易發年齡，所以一般兔場很少見家兔腫瘤的發生。在實際生產中，毛兔養殖時間通常在2年以上，由于毛兔養殖時間周期長，發生腫瘤的概率也大大增加。

本試驗首次報道了兔口腔鱗狀細胞癌。本試驗結果提高了人們對動物腫瘤病，特別是兔口腔惡性腫瘤的認識，為未來相關疾病的診斷和研究提供了科學依據。然而，本病產生的具體原因不明，推測可能與飲食、微生物、遺傳因素及品種等因素有關[13-14]。在調研中發現，養殖戶在選育過程中更偏愛卷毛的兔子，選育的卷毛兔更容易得口腔惡性腫瘤，這可能與卷毛兔自身存在基因缺陷有關。在江蘇鹽城等地調研中也發現類似病例，均為毛兔發病，在養毛期相同的情況下，易發病兔的被毛比正常毛兔被毛長，且前端易卷曲，也進一步證實了該病的發生和遺傳因素可能有較大關聯。

目前，口腔腫瘤的臨床治療中通常采取包括手術、化學藥物、放射、加熱治療以及營養治療等具有針對性的治療方式，并在綜合治療原則的基礎上，將各個治療方法進行有效的聯合[2]。由于鱗狀細胞癌的具體病因還不清楚，暫時還沒有行之有效的預防手段，在本試驗中，考慮到經濟效益的因素，為了預防腫瘤的發生以及減小腫瘤疾病對家兔的影響，建議養殖場加強飼養管理，在選育過程中，選擇沒有腫瘤的母兔進行繁殖，如遇到有腫瘤的母兔應及時停止繁育并淘汰。對于寵物兔而言，由于大部分品種有毛兔的遺傳背景，且飼養時間相對較長，參考犬、貓等寵物的相關報道[4,15]，建議在沒有轉移病灶的情況下，第一時間手術切除全部腫瘤，這樣對治愈該病可起到積極作用，也可在確診后進行安樂死。