豬流行性腹瀉病毒與新發腹瀉病毒混合感染分析

焦文強，邢廣旭，徐引弟，王 麗，王治方，王克領

(1.河南省農業科學院畜牧獸醫研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，河南 鄭州 450002)

豬德爾塔冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)于2012年在香港首次報道[1]，目前亞洲的多個國家均有PDCoV的報道[2-4]，在我國，多個省份也都檢測到PDCoV，發病率差異較大[5-7]。其臨床表現比豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)相對溫和，但是不同區域陽性率差異較大，可能是由于PDCoV不斷遺傳變異導致不同區域的流行毒株毒力差異。豬腸道α冠狀病毒(Porcine enteric alphacoronavirus,PEAV)由2個研究團隊于2017年報道，其是一種新型Bat-HKU2樣冠狀病毒[8-9]，死亡率高達90%[10]。

仔豬腹瀉是危害養豬業健康發展的重要疫病，目前引起仔豬腹瀉病原種類繁多，多種病原混合感染是誘發仔豬腹瀉的重要原因。PEDV是當前主要的仔豬腹瀉病原，PDCoV和PEAV是近年來新近報道誘發腹瀉的病原體，但是目前尚沒有報道證明PDCoV、PEAV和PEDV混合感染的情況。因此，對這3種病原混合感染情況進行分析可以確定目前仔豬腹瀉中新發病原與現存主要病原在豬群中的流行情況，為腹瀉類疾病防控措施提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 反轉錄酶M-MLV、DL2 000 DNA marker、PrimeSTAR Max Premix(2×)高保真酶、DNA純化回收試劑盒、小量質粒提取試劑盒、pMD20-T simple載體、大腸桿菌JM109感受態細胞均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；RNA提取試劑盒，購自QIAGEN公司。

1.2 病料 鑒定為PEDV陽性的腹瀉疑似病料(2014—2018年采集于河南、河北、山東、山西、江西等省份)由河南省農業科學院畜牧獸醫研究所保存。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設計與合成 檢測PDCoV引物根據病毒保守區域設計合成，上游引物：5′-GCTGATGATCTACTCGATT-3′,下游引物：5′-ACTACTTCAAGCTCAGGGAGCTT-3′，目的片段大小約為866 bp。檢測PEAV的引物參考PEAVS基因的序列，上游引物：5′-GGCCTCTATTAGAGTGCTTTA-3′,下游引物:5′-GTAGGATATTCAACCTCACTAT-3′，目的片段大小為770 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3.2 PDCoV和PEAV的檢測 按照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA后進行反轉錄，以反轉錄合成的cDNA為模板進行PCR反應，PCR反應體系和反應程序參考Prime STAR Max Premix(2×)高保真說明書進行，反應結束后取5 μL樣品進行凝膠電泳檢測。

1.3.3 PDCoV和PEAVS基因的克隆 對于PDCoV和PEAV陽性的樣品，采用參考文獻[11-12]的引物進行S基因全長的擴增。PCR擴增結束后回收目的片段，并與pMD20-T simple連接，轉化至JM109感受態細胞，挑選陽性克隆進行測序，使用DNASTAR中的 Edit Seq進行序列拼接，采用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹。

2 結果

2.1 PEDV、PDCoV和PEAV共感染的比例 在191份檢測為PEDV陽性樣品中，PDCoV和PEAV陽性樣品分別為12份和1份。PEDV、PDCoV和PEAV共感染的比例為0.52%。PDCoV和PEAV擴增結果如圖1所示。

圖1 PDCoV和PEAV的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of PDCoV and PEAVM:DL2 000 DNA 相對分子質量標準；1～2:陰性對照；3～4:陽性對照；5～6:PDCoV與PEAV基因片段M:DL2 000 DNA marker;1-2:Negative control;3-4:Positive control;5-6:PDCoV and PEAV gene fragment

2.2 PDCoV和PEAVS基因的克隆 本試驗共獲得5株PDCoVS基因序列，但未能得到PEAV毒株S基因序列。

2.3 PDCoV 核苷酸與氨基酸同源性分析 將本試驗得到的CH-HEBHD-2016(2016年采集自河北邯鄲)、CH-HENNY-2017(2017年采集自河南南陽)、CH-HENXY-2016(2016年采集自河南信陽)、CH-HENZK-2017(2017年采集自河南周口)、CH-SHANXCZ-2017(2017年采集自山西長治)這5株PDCoVS基因序列與GenBank中下載的序列進行比對，結果如圖2、圖3所示，本試驗得到的5株序列與GenBank中下載的序列核苷酸同源性為97.2%～99.3%，氨基酸同源性在96.6%～98.9%。

圖2 PDCoV S基因核苷酸序列的比對分析Fig.2 Nucleotide homology comparative analysis of S gene of PDCoV

圖3 PDCoV S基因氨基酸序列的比對分析Fig.3 Amino acid homology comparative analysis of S gene of PDCoV

2.4 PDCoVS基因遺傳進化分析 將本試驗得到的5株PDCoV與GenBank中下載的序列構建系統進化樹，如圖4所示，CH-HENNY-2017、CH-HENXY-2016、CH-SHANXCZ-2017、CH-HEBHD-2017這4株序列與HNZK-06形成一個分支，親緣關系比較接近；而CH-HENZK-2017與CH-GDD5-2014、CH-SXD2-2015形成一個分支，親緣關系較為接近。

圖4 基于PDCoV S基因的系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of PDCoV based on S gene▲：本試驗分離株▲：The strains isolated in this study

3 討論

腹瀉類疾病一直是困擾養豬業健康發展的重要疾病，特別是哺乳仔豬，腹瀉不僅會造成斷奶仔豬體重下降，影響保育豬增重，并且降低豬只對疾病抵抗力；嚴重的腹瀉會因脫水而死亡。冠狀病毒是影響仔豬腹瀉的重要病原之一，PDCoV和PEAV是新近報道的2種誘發腹瀉的冠狀病毒，對臨床采集樣本進行PDCoV和PEAV感染情況分析對于腹瀉疫病的防控具有重要意義；同時，PEDV已經被確定為目前引起仔豬腹瀉的最主要的病原，考慮到臨床生產中疫病混合感染的復雜性和多樣性，開展PEDV、PDCoV和PEAV共感染分析，對于仔豬腹瀉的防控具有重要意義。

本試驗中，在191份檢測為PEDV陽性樣品中，PDCoV和PEAV陽性樣品分別為12份和1份。PEDV、PDCoV和PEAV共感染的比例為0.52%。共得到5株PDCoV序列，未能得到PEAV毒株S基因序列。結果表明，目前河南省及周邊省份PEDV仍然是主要的仔豬腹瀉病原，但是PDCoV與PEAV也已經在豬群中傳播，未來仔豬腹瀉病原可能更加復雜。由于冠狀病毒的S蛋白識別并結合細胞表面受體，誘導病毒囊膜和靶細胞膜進行融合，其編碼的抗原表位誘導產生中和抗體，因此，S蛋白被廣泛用于疫苗研發和遺傳進化分析[13]。

根據PDCoV 5株序列的核苷酸和氨基酸比對結果分析，這5株序列與國內分離株核苷酸同源性為97.2%～99.3%，氨基酸同源性為96.6%～98.9%，表明核苷酸編碼的氨基酸已經發生變異，這種變異對于病毒的致病性和相關生物活性的影響有待于進一步分析。系統進化樹分析表明，CH-HENNY-2017、CH-HENXY-2016、CH-SHANXCZ-2017、CH-HEBHD-2017這4株序列與HNZK-06形成一個分支，親緣關系比較接近，呈現出明顯的低于特征；而CH-HENZK-2017與CH-GDD5-2014、CH-SXD2-2015形成一個分支，親緣關系較為接近。本試驗結果提示，河南范圍內流行的PDCoV可能是多種不同亞型，相互之間發生變異或者重組。由于本試驗獲得的樣本數過少，需加大臨床中PDCoV的采集工作，獲得更多的PDCoV數據才能夠進一步分析。