復方鹽酸利多卡因凝膠劑中鹽酸利多卡因和恩諾沙星含量的測定方法

金禮琴，金 星，吳秋萍，宋子域，喬秋萍，黃學林，馬保臣，2

(1.江蘇中牧倍康藥業有限公司，江蘇 泰州 225300；2.中國牧工商集團有限公司，北京 豐臺 100070)

鹽酸利多卡因(Lidocaine hydrochloride,LID)是一種常用的酰胺類中效局部麻醉藥[1]，具有起效較快、黏膜穿透力較強及安全范圍較大等特點[2]，臨床上主要用于浸潤麻醉、表面局麻、神經阻斷、脈管給藥、硬膜外麻醉及快速型抗室性心律失常[3-4]，利多卡因成癮性較低，也少有過敏反應的報道[5]。恩諾沙星(Enrofloxacin,EF)是一種廣譜、高效、低毒的喹諾酮類抗菌藥[6-7]，由于其直接作用于細菌的核，抑制細菌的DNA旋轉酶，能迅速殺死細菌而被廣泛運用于各種動物感染性疾病的預防和治療[8-9]。

目前市場上以鹽酸利多卡因注射液居多[10]，少部分廠家生產鹽酸利多卡因膠漿劑，本試驗中的復方利多卡因凝膠劑是以鹽酸利多卡因和恩諾沙星為活性成分組成的復方制劑，填補了寵物臨床可用的利多卡因表面麻醉劑的劑型空白，在局部麻醉的基礎上增加了抗菌特性，兩者聯用能各自發揮原來的功效。為建立復方鹽酸利多卡因凝膠劑的質量標準，本試驗探討高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)法分別測定復方鹽酸利多卡因凝膠劑中鹽酸利多卡因和恩諾沙星含量的方法，為該制劑質量的控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鹽酸利多卡因對照品(含量93.4%)、恩諾沙星對照品(含量99.5%)，均購自中國獸醫藥品監察所；乙腈(色譜純)，購自美國DIKMA公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸、三乙胺，均購自國藥集團生化試劑有限公司；復方鹽酸利多卡因凝膠劑由江蘇中牧倍康藥業有限公司研制。

1.2 主要儀器 LC-10Avp高效液相色譜儀、LC-10ATvp雙泵、SPD-10Avp可見-紫外檢測器、CTO-10ASvp柱溫箱，日本島津公司；N-2000色譜工作站，浙江智達公司；AS1201全自動進樣器，大連依利特公司；BS224S電子天平、BP211D電子天平，北京賽多利斯公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司；FSH-2A高速勻漿機，金壇市醫療儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 復方鹽酸利多卡因凝膠中利多卡因的含量測定

1.3.1.1 溶液的配制 鹽酸利多卡因標準品溶液的制備：精密稱取鹽酸利多卡因標準品25 mg，置50 mL量瓶中，用流動相定容，混勻，即制成0.5 mg/mL的標準品溶液。鹽酸利多卡因供試品溶液的制備：取本品適量(約相當于鹽酸利多卡因25 mg)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動相約30 mL，振搖溶解，超聲處理20 min，冷卻至室溫，加流動相定容至刻度，離心(10 000 r/min，10 min，20 ℃)，取上清液濾過，取續濾液，即得。陰性對照液的制備：按處方比例精密稱取復方鹽酸利多卡因凝膠劑中除鹽酸利多卡因原料藥外的其他成份，按復方鹽酸利多卡因凝膠劑工藝制備，再按“鹽酸利多卡因供試品溶液的制備”項下方法制備，即得陰性對照液。

1.3.1.2 系統適用性考察 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液(取1 mol/L磷酸二氫鈉溶液1.3 mL與0.5 mol/L磷酸氫二鈉溶液32.5 mL，用水稀釋至1 000 mL，搖勻)-乙腈(50∶50)(用磷酸調節至pH 8.0)為流動相；檢測波長為254 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35.0 ℃；檢測濃度0.5 mg/mL；進樣量20 μL；理論板數按利多卡因峰計算不低于2 000[11]。分別取對照品溶液、陰性對照溶液、供試品溶液各20 μL，進樣測定。

1.3.1.3 線性范圍 精密稱取鹽酸利多卡因對照品53.80 mg，置25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液0.5、1.0、2.0、3.0 mL 和5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成不同濃度的對照品溶液。精密吸取上述不同濃度的對照品溶液20 μL，分別進樣測定峰面積。

1.3.1.4 精密度試驗 按“鹽酸利多卡因標準品溶液的制備”項下的方法制備鹽酸利多卡因對照品溶液1份，精密吸取20 μL，連續進樣檢測6次，記錄色譜圖。

1.3.1.5 重復性試驗 精密稱取同一批號的樣品6份，按“鹽酸利多卡因供試品溶液的制備”項下的方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL，進樣檢測，記錄色譜圖。

1.3.1.6 加樣回收率試驗 用鹽酸利多卡因對照品替代鹽酸利多卡因原料藥，分別制備3份鹽酸利多卡因含量為處方比例的80%、100%、120%的低、中、高3種濃度加樣回收樣品，然后每份樣品制備成均為0.5 mg/mL濃度的供試品溶液，每種濃度平行配制3份，按“鹽酸利多卡因供試品溶液的制備”項下的方法處理，精密吸取20 μL，進樣檢測，記錄色譜圖。

1.3.1.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液20 μL，按上述色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12 h和24 h各進樣1次，記錄色譜圖。

1.3.1.8 定量限 按信噪比10∶1為標準，精密稱取鹽酸利多卡因對照品適量，加流動相稀釋制成相應濃度，進樣檢測，記錄色譜圖。

1.3.1.9 樣品測定 取3批復方鹽酸利多卡因凝膠劑樣品制成供試品溶液，分別精密量取20 μL，進樣檢測，記錄色譜圖。

1.3.2 復方利多卡因凝膠中恩諾沙星的含量測定

1.3.2.1 溶液的配制 恩諾沙星對照品溶液的制備：精密稱取恩諾沙星對照品25 mg，置100 mL量瓶中，用流動相定容，混勻，作為恩諾沙星對照品儲備液。精密量取恩諾沙星對照品儲備液5 mL置50 mL量瓶中，用流動相定容，混勻，即制成25 μg/mL的標準品溶液。恩諾沙星供試品溶液的制備：取本品適量(約相當于恩諾沙星25 mg)，精密稱定，置100 mL燒杯中，加入少量流動相，超聲振搖至分散均勻后，轉移至100 mL量瓶中，加流動相定容至刻度，混勻，精密量取5 mL置50 mL量瓶中，用流動相定容，混勻，即得。陰性對照液的制備：按處方比例精密稱取復方鹽酸利多卡因凝膠劑中除恩諾沙星原料藥外的其他成份，按復方鹽酸利多卡因凝膠劑工藝制備，再按“恩諾沙星供試品溶液的制備”項下方法制備，即得陰性對照液。

1.3.2.2 系統適用性考察 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0.025 mol/L磷酸溶液(用三乙胺調節至pH 3.0)-乙腈(83∶17)為流動相；檢測波長278 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35.0 ℃；檢測濃度25 μg/mL；進樣量20 μL；理論板數按恩諾沙星峰計算不低于2 500[11]。分別取對照品溶液、陰性對照液、供試品溶液各20 μL，進樣測定。

1.3.2.3 線性范圍 精密吸取“恩諾沙星對照品溶液的制備”項中恩諾沙星對照品儲備液0.5、1.0、2.0、3.0 mL和5.0 mL，分別置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成不同濃度的對照品溶液。精密吸取上述不同濃度的對照品溶液20 μL，分別進樣測定峰面積。

1.3.2.4 精密度試驗 按“恩諾沙星對照品溶液的制備”項下的方法制備恩諾沙星對照品溶液 1份，精密吸取20 μL，連續進樣檢測6次，記錄色譜圖。

1.3.2.5 重復性試驗 精密稱取同一批號的樣品6份，按“恩諾沙星供試品溶液的制備”項下的方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL，進樣檢測，記錄色譜圖。

1.3.2.6 加樣回收率試驗 用恩諾沙星對照品替代恩諾沙星原料藥，分別制備3份恩諾沙星含量為處方比例的80%、100%、120%的低、中、高3種濃度加樣回收樣品，然后每份樣品制備成均為25 μg/mL濃度的供試品溶液，每種濃度平行配制3份，同“恩諾沙星供試品溶液的制備”項下的方法處理，精密吸取20 μL，進樣檢測，記錄色譜圖。

1.3.2.7 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液20 μL，按上述色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12 h和24 h各進樣1次，記錄色譜圖。

1.3.2.8 定量限 按信噪比10∶1為標準，精密恩諾沙星對照品適量，加流動相稀釋制成相應濃度，進樣檢測，記錄色譜圖。

1.3.2.9 樣品測定 取3批復方鹽酸利多卡因凝膠劑樣品制成供試品溶液，分別精密量取20 μL，進樣檢測，記錄色譜圖。

2 結果

2.1 鹽酸利多卡因含量測定

2.1.1 系統適用性考察 陰性對照溶液無干擾，對照品和供試品溶液出峰時間基本一致，表明本方法專屬性良好。見圖1。

圖1 鹽酸利多卡因系統適用性色譜圖Fig.1 Chromatograms of system applicability of lidocaine hydrochloride

2.1.2 線性范圍 以對照品濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，進行回歸分析，得線性回歸方程:y=2×106x+36 746，R=0.999 9(n=5)。結果表明鹽酸利多卡因濃度在0.100 5～1.004 9 mg/mL范圍內，與峰面積呈良好線性關系，結果見圖2。

圖2 鹽酸利多卡因線性關系Fig.2 Linear relationship of lidocaine hydrochloride

2.1.3 精密度試驗 結果見表1。鹽酸利多卡因的RSD為0.72%。

表1 鹽酸利多卡因精密度試驗結果Table 1 The precision test results of lidocaine hydrochloride

2.1.4 重復性試驗 結果見表2。鹽酸利多卡因的平均含量為標示量的101.01%，RSD為0.44%。

表2 鹽酸利多卡因重復性試驗結果Table 2 The reproducibility test results of lidocaine hydrochloride

2.1.5 回收率試驗 結果見表3。鹽酸利多卡因的平均回收率為99.2%，RSD為0.77%。試驗結果良好，符合《中國獸藥典》質量標準中回收率試驗要求。

表3 鹽酸利多卡因回收率試驗結果Table 3 The recovery rate test results of lidocaine hydrochloride

2.1.6 穩定性試驗 結果見表4。樣品中鹽酸利多卡因峰面積RSD為0.54%，表明樣品溶液在室溫下放置24 h含量穩定性良好。

表4 鹽酸利多卡因穩定性試驗結果Table 4 The stability test results of lidocaine hydrochloride

2.1.7 定量限 按信噪比10∶1為標準，測得鹽酸利多卡因的定量限為5 μg/mL。

2.1.8 樣品測定 3批復方鹽酸利多卡因凝膠劑樣品中的鹽酸利多卡因測定結果見表5。由表5可知，鹽酸利多卡因的含量均在標示量的95.0%～105.0%，符合《中國獸藥典》通常規定的含量限度范圍，平均相對偏差也符合檢驗要求。

表5 樣品中鹽酸利多卡因含量測定結果Table 5 Determination results of lidocaine hydrochloride in samples

2.2 恩諾沙星含量測定

2.2.1 系統適用性考察 如圖3所示，陰性對照溶液無干擾，對照品和供試品溶液出峰時間基本一致，表明本方法專屬性良好。

圖3 恩諾沙星系統適用性色譜圖Fig.3 Chromatograms of system applicability of enrofloxacin

2.2.2 線性范圍 以對照品濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，進行回歸分析，得線性回歸方程:y=141 315x-1 107，R=0.999 6(n=5)。結果表明恩諾沙星濃度在4.98～49.79 μg/mL范圍內，與峰面積呈良好線性關系，結果見圖4。

圖4 恩諾沙星線性關系Fig.4 Linear relationship of enrofloxacin

2.2.3 精密度試驗 結果見表6。恩諾沙星的RSD為0.24%，結果表明儀器精密度符合要求。

表6 恩諾沙星精密度試驗結果Table 6 The precision test results of enrofloxacin

2.2.4 重復性試驗 結果見表7。恩諾沙星的平均含量為標示量的99.76%，RSD為0.81%，結果表明該方法重復性良好。

表7 恩諾沙星重復性試驗結果Table 7 The reproducibility test results of enrofloxacin

2.2.5 回收率試驗 結果見表8。恩諾沙星的平均回收率為100.28%，RSD為0.88%。試驗結果良好，符合《中國獸藥典》質量標準中回收率試驗要求。

表8 恩諾沙星回收率試驗結果Table 8 The recovery rate results of enrofloxacin

2.2.6 穩定性試驗 結果見表9。樣品中恩諾沙星峰面積RSD為0.62%，表明樣品溶液在室溫下放置24 h含量穩定性良好。

表9 恩諾沙星穩定性試驗結果Table 9 The stability test results of enrofloxacin

2.2.7 定量限 按信噪比10∶1為標準，測得恩諾沙星的定量限為6 ng/mL。

2.2.8 樣品測定 3批復方鹽酸利多卡因凝膠劑樣品中的恩諾沙星測定結果見表10。由表10可知，恩諾沙星的含量均在標示量的90.0%～110.0%，符合《中國獸藥典》通常規定的含量限度范圍，平均相對偏差也符合檢驗要求。

表10 樣品中恩諾沙星含量測定結果Table 10 Determination results of enrofloxacin content in samples

3 討論

《中國獸藥典》2015版中規定的鹽酸利多卡因測定含量的濃度為2 mg/mL[11]，前期預試驗中發現以該濃度配制供試品時，檢測的鹽酸利多卡因含量與理論值相差較大，故本方法調整進樣濃度為0.5 mg/mL，克服了含量檢測效果不理想的問題。

方法學考察結果表明，鹽酸利多卡因色譜條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以磷酸鹽緩沖液-乙腈(50∶50)(用磷酸調節至pH 8.0)為流動相，檢測波長為254 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL，在此條件下，鹽酸利多卡因在0.100 5～1.004 9 mg/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數R為0.999 9；精密度試驗結果為0.72%；重現性試驗結果為檢測的平均含量為標示量的101.01%，RSD為0.44%；平均加樣回收率為99.2%，RSD為0.77%；放置24 h含量無明顯變化，RSD為0.54%；鹽酸利多卡因的定量限為5 μg/mL。

恩諾沙星色譜條件為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以0.025 mol/L磷酸溶液(用三乙胺調節至pH 3.0)-乙腈(83∶17)為流動相，檢測波長278 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL，在此條件下，恩諾沙星在4.98～49.79 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數R為0.999 6；精密度試驗結果為0.24%；重現性試驗結果為檢測的平均含量為標示量的99.76%，RSD為0.81%；平均加樣回收率為100.3%，RSD為0.88%；放置24 h含量無明顯變化，RSD為0.62%；恩諾沙星的定量限為6 ng/mL。

本方法在一定的濃度范圍內線性、精密度、重現性、回收率和穩定性俱佳，故該方法可作為復方鹽酸利多卡因凝膠劑中鹽酸利多卡因和恩諾沙星的含量測定方法。