豬圓環病毒3型Cap蛋白的原核表達及其免疫原性分析

騰召劍，林依丹，周雙海，李潭清，張義明，宋勤葉，鄭士學

(1.河北農業大學動物醫學院 河北省獸醫生物技術創新中心，河北 保定 071000；2.北京農學院動物科學技術學院，北京 昌平 102206)

豬圓環病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)與豬皮炎腎病綜合征、多器官炎癥以及母豬繁殖障礙等多種病癥相關[1-3]。該病毒于2015年首次在美國豬場患多器官炎癥的仔豬及患皮炎腎病綜合征伴發繁殖障礙癥狀的母豬與死胎的組織中發現[4-5]，隨后在中國、日本、韓國等國家和地區的豬群中檢測到了該病毒，不同地區或豬場的感染率在9.6%～52.0%[1,6-7]。此外，在野豬、牛、狗、鹿及蜱等體內也檢測到PCV3[8-9]，表明PCV3不僅對全球養豬生產構成了潛在威脅，而且可在家畜、野生動物和節肢動物間循環。

PCV3屬于圓環病毒科圓環病毒屬成員，基因組全長2 000 bp。與豬圓環病毒2(PCV2)相似，PCV3具有圓環病毒典型的基因組結構和遺傳特性，包括3個主要開放閱讀框(Open reading frame,ORFs)，即ORF1、ORF2和ORF3[4-5]。其中ORF1較保守，編碼復制酶；ORF2容易突變，編碼214 aa的衣殼(Capsid,Cap)蛋白，該蛋白是病毒入侵、復制和誘導宿主免疫應答的最重要蛋白，并且與病毒變異密切相關[10-12]；ORF3編碼231 aa，其功能不詳[5]。目前，對PCV3的致病機制及其編碼蛋白的生物學功能了解很少，獲取具有良好生物學活性的Cap蛋白對于深入了解PCV3的感染免疫特征及其防治具有重要意義。本試驗旨在應用大腸桿菌表達系統，體外表達PCV3-Cap蛋白，分析蛋白的抗原表位及其免疫原性，為PCV3免疫學特性、亞單位疫苗及相關檢測方法的研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌種與實驗動物 克隆PCV3-Cap蛋白基因序列的重組質粒(pMD-PCV3-ORF2)，由本實驗室構建保存；大腸桿菌(E.coli)感受態細胞DH5α、Rosetta(DE3)均由本實驗室保存；BALB/c小鼠(6～8 周齡)，購自河北醫科大學動物實驗中心。

1.2 主要試劑EcoR Ⅰ、XhoⅠ限制性內切酶、DL10 000 DNA marker、Premixed Protein Marker(Broad)、Premixed Protein Marker(Low)，均購自寶生物工程(大連)有限公司；抗His標簽兔多克隆抗體，購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白Marker Ⅱ，購自天根生化科技(北京)有限公司；2×TaqMasterMix(Dye)、His-Tagged Protein Purification Kit和羊抗兔IgG-HRP，均購自康為世紀生物科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)，均購自Promega公司。

1.3 PCV3-Cap蛋白基因的PCR擴增 參考PCV3 HB-1/2016毒株(GenBank登錄號：MF593110)的ORF2序列，應用Oligo 6.0設計擴增Cap蛋白基因序列(不含5′端核定位序列)的特異性引物，即PCV3-e2Cap-F:5′-CGTGAATTCTACTCCACCATGAA CGTC-3′和PCV3-e2Cap-R:5′-CTGCTCGAGTTAGA-GAACGGACTTGTA-3′，分別在上下游引物的5′端引入限制性核酸內切酶EcoR Ⅰ、XhoⅠ堿基序列(下劃線堿基)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以重組質粒pMD-PCV3-ORF2為模板進行PCR，擴增Cap基因片段。PCR擴增體系為50 μL，包括2×TaqMaster Mix(Dye)25 μL、PCV3-e2Cap-F/R各1 μL、模板1 μL、ddH2O 22 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA回收試劑盒純化回收目的基因片段。

1.4 重組表達載體的構建及鑒定 用EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制性核酸內切酶消化純化回收的PCR產物與質粒pET-28a(+)，回收酶切后的Cap基因與質粒pET-28a(+)；用T4 DNA連接酶連接Cap基因片段與質粒pET-28a(+)，將連接產物轉化至E.coliDH5α感受態細胞；將菌液涂布到卡那霉素(Kan+)抗性(30 μg/mL)的LB固體培養基上，于37 ℃下培養18～24 h；挑取菌落接種到Kan+/LB液體培養基內振搖培養16 h，提取質粒(pET-28a-PCV3-Cap)，經PCR和EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切鑒定后，送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 重組蛋白的表達及其表達形式檢測 將構建的重組質粒轉化至E.coliRosetta(DE3)感受態細胞中，涂布到Kan+/LB固體培養基上，37 ℃下過夜培養，挑取單個菌落接種到5 mL Kan+/LB液體培養基中，37 ℃下200 r/min振搖培養，至OD600值為0.6～0.8時，加入終濃度為0.1、0.5、1.0 mmol/L和1.5 mmol/L的IPTG，于18、21、25、28、31、34 ℃和37 ℃不同溫度下、230 r/min誘導表達3、4、5 h和6 h。同時設立轉化空質粒pET-28a(+)的Rosetta(DE3)和Rosetta(DE3)菌株作為陰性對照。收集誘導后的菌體進行SDS-PAGE，分析目的蛋白的表達情況，確定目的蛋白的最佳表達條件，并用His-Tagged蛋白純化試劑盒純化蛋白。

1.6 Western Blot鑒定 取蛋白表達陽性菌株和轉化空質粒菌株的誘導產物經SDS-PAGE后，將蛋白轉印至PVDF膜上，將膜放入封閉液(含5%脫脂奶粉、0.05% Tween-20的PBS)中，于4 ℃封閉過夜；加入兔抗His標簽多克隆抗體(1∶1 000倍稀釋)，室溫下反應1.5 h；洗膜，加入羊抗兔IgG-HRP(1∶3 000 倍稀釋)于室溫下反應1.5 h；洗膜，將膜放入顯色液(DAB)中，顯色3～10 min，終止反應，檢測融合目的蛋白的表達情況。

1.7 基于液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)技術的蛋白鑒定 取50 μg純化的重組蛋白，加入糜蛋白酶進行酶切，取10 μg 酶切后肽段，經脫鹽柱脫鹽，于45 ℃真空干燥，用于LC-MS/MS檢測。采用MaxQuant(1.6.2.10)軟件對質譜數據進行分析，搜索的數據庫為NCBI-PCV3。

1.8 抗原表位預測與分析 在線(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.html)預測表達的Cap蛋白與參考毒株PCV3-US/SD2016 Cap蛋白(GenBank收錄號：APC65716)的抗原表位，比較兩者的異同，分析表達蛋白的抗原性。

1.9 動物試驗 取重組Cap蛋白以等體積的弗氏完全佐劑乳化后，背部皮下接種8只6～8周齡的BALB/c小鼠，每只50 μg蛋白/0.1 mL；同時設立陰性對照小鼠。分別間隔2周，進行第2次和第3次接種，皮下注射弗氏不完全佐劑乳化的重組蛋白，每只50 μg 蛋白/0.1 mL。第3次接種后10 d，應用ELISA檢測血清中的特異性抗體效價。ELISA主要步驟：用0.1 μg的重組Cap蛋白加入酶標板孔內，于4 ℃包被過夜；用PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L pH 7.4的PBS)洗滌3次，每孔加入100 μL 封閉液(含5%犢牛血清的PBST)，37 ℃封閉1 h；棄封閉液，加入100 μL 1∶100～1∶204 800倍比稀釋的待測血清，37 ℃反應45 min；洗滌后，每孔加入100 μL 1∶5 000倍稀釋的HRP-羊抗小鼠IgG，37 ℃ 孵育45 min；洗滌，每孔加100 μL TMB于室溫避光顯色15 min；每孔加入100 μL 2 mol/L H2SO4終止反應；用酶標儀測定各孔OD450 nm光吸收值(OD450 nm值≥0.3時，判定血清特異性抗體陽性)。

2 結果

2.1 重組質粒的構建與鑒定 應用PCR擴增到了大小528 bp的Cap蛋白基因序列，構建的重組質粒經EcoR Ⅰ和XhoⅠ消化，可以釋放出預期大小的目的片段(圖1)，序列測定顯示，在重組質粒內包含目的條帶，與參考序列的同一性為100%。表明成功構建了重組表達質粒pET-28a-PCV3-Cap。

圖1 重組表達質粒的PCR和酶切鑒定Fig.1 Identification of the recombinant expression plasmids by PCR and restriction analysis1:陽性對照;2～3:分別為重組質粒和空質粒的PCR產物;4～5:分別為重組質粒和空質粒的EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鑒定;M:DL10 000 DNA marker1:Positive control;2-3:PCR products of the recombinant plasmid and the blank plasmid,respectively;4-5:Identification of the recombinant plasmid and the blank plasmid by restriction analysis with EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ;M:DL10 000 DNA marker

2.2 蛋白的表達 轉化重組質粒的菌株pET-28a-PCV3-Cap/Rosetta(DE3)在31 ℃下用0.5 mmol/L的IPTG誘導4 h后，可表達預期大小(25.4 kDa)的蛋白條帶。而轉化空質粒的菌株pET-28a(+)/Rosetta(DE3)和工程菌Rosetta(DE3)在誘導后，均沒有相應大小的蛋白條帶表達(圖2)。收集誘導后的菌體，經超聲破碎、離心后，取上清和沉淀經SDS-PAGE檢測，發現蛋白以包涵體形式表達(圖略)。

圖2 PCV3-Cap蛋白的原核表達Fig.2 Procaryotic expression of PCV3-Cap proteinM:預混蛋白分子量標準;1～2:IPTG誘導前后Rosetta(DE3);3～4:IPTE誘導前后的pET-28a-PCV3-Cap/Rosetta(DE3)5～6：IPTE誘導前后的pET-28a(+)/Rosetta(DE3)M:Premixed orotein marker(Broad);1-2:Rosetta(DE3)before and after IPTG induction;3-4：pET-28a-PCV3-Cap/Rosetta(DE3) before and after IPTG induction;5-6:pET-28a(+)/Rosetta (DE3)before and after IPTG induction

2.3 蛋白的Western Blot分析 將SDS-PAGE凝膠中的蛋白轉印至PVDF膜上，與兔抗His標簽多克隆抗體反應后，轉化重組質粒菌株在約25 kDa處出現清晰的反應條帶(中插彩版圖3)，表明Cap基因在大腸桿菌Rosetta(DE3)中得到了成功表達。

圖3 重組Cap蛋白的Western Blot分析Fig.3 Western Blot analysis of recombinant Cap protein M：蛋白質marker Ⅱ；1：轉化重組質粒菌株的表達產物；2：轉化空質粒菌株的表達產物M:Protein marker Ⅱ;1:Expression products of the strain with the recombinant expression plasmid;2:Expression products of the strain with the blank plasmid

2.4 蛋白酶解肽段的LC-MS/MS分析 應用MaxQuant(1.6.2.10)軟件對重組蛋白的LC-MS/MS檢測數據(圖4A)進行分析，其氨基酸序列與參考毒株PCV3-US/SD2016(GenBank登錄號：APC65716)的Cap蛋白序列(不含核定位序列)的一致性為88.4%(152/172 aa)(圖4B)，證明表達的蛋白為PCV3-Cap蛋白。

圖4 Cap蛋白的LC-MS/MS檢測Fig.4 Detection of Cap protein by LC-MS/MSA：總離子流色譜圖；B：鑒定的氨基酸序列(加下劃線的序列與參考序列一致)A:Total ion chromatogram;B:Identified amino acid sequence(the underlined sequences are the same as those of the reference)

2.5 蛋白的抗原表位 如表1所示，參考毒株的Cap蛋白共有6個抗原表位，其中1個表位(24VRRKLFIR31)位于N端核定位信號區域內。除不含核定位信號區域的1個表位外，表達的Cap蛋白所含的5個抗原表位與參考序列的完全一致。

表1 表達蛋白與PCV3-Cap蛋白參考序列之間的預測抗原表位比較Table 1 Comparison of predicted antigenic determinants in the expressed protein with those in PCV3-Cap reference sequence

2.6 蛋白的抗原活性 以表達的Cap蛋白第3次免疫BALB/c小鼠后10 d，用ELISA在免疫小鼠血清中均檢測到了Cap蛋白特異性抗體，抗體效價≥1∶12 800(圖5)。該結果表明，表達的重組蛋白具有良好的免疫活性。

圖5 PCV3-Cap蛋白免疫小鼠的血清特異性ELISA抗體水平Fig.5 Serum specific ELISA antibody level of mice immunized with PCV3-Cap proteinNegative：非免疫對照小鼠的血清混合物(n=3)Negative:The pools of serum from non-immunized control mice(n=3)

3 討論

Cap蛋白是解析PCV致病機制及PCV疫苗和檢測技術研究的關鍵靶蛋白[10]，基于真核或原核表達系統表達的PCV2-Cap蛋白制成的亞單位疫苗和研制的檢測技術均已經廣泛應用PCV2的免疫防控和檢測中。PCV3具有與PCV2類似的基因組結構，初步研究發現，PCV3-Cap蛋白在體外可以抑制I型干擾素反應[12]，在Cap蛋白上鑒定出3個線性B細胞表位(57NKPWH61、140KHSRYFT146和161QSLFFF166)[13]。為深入解析Cap蛋白的抗原表位與免疫功能，為相關疫苗和檢測技術研究提供科學依據，同時考慮到原核表達系統操作簡單、蛋白表達量高、成本低，更適合將來開發應用，本試驗應用E.coli表達系統體外表達了重組Cap蛋白。

由于Cap蛋白N端的核定位信號序列含有豐富的精氨酸殘基和大腸桿菌稀有密碼子，致使利用原核表達系統無法表達完整的Cap蛋白或蛋白表達量過低[14]。因此，表達Cap蛋白時，需要對N端核定位信號序列進行密碼子優化，或者截掉該區域[15]。鑒于預測PCV3-Cap蛋白的抗原表位主要分布在核定位序列之后的區域，本試驗在構建表達載體時，采取了缺失核定位信號序列的方案。此試驗設計與文獻[16]報道的相似。由于目前沒有商品化的PCV3特異性抗體用于Cap蛋白的鑒定，所以很多報道都是用抗His標簽抗體間接證明目的蛋白得到了表達[15]，但是無法真正了解表達蛋白的氨基酸序列，故本試驗除了用抗His標簽抗體證明目的蛋白表達外，進一步應用LX-MS/MS技術分析了表達蛋白的氨基酸序列，證明目的蛋白的氨基酸序列與推導的PCV3 Cap蛋白參考序列高度一致，抗原表位完全吻合，并通過動物免疫試驗證明表達的蛋白具有良好的免疫原性。但本試驗預測的抗原表位與文獻[13]報道的抗原表位不完全相符，對此需要進一步試驗證明。