牛副結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

王一新，周曉翠，高 超，趙 鵬，翟少華，馮 宇，李 陽

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271018；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；4.中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東 青島 266114)

牛副結(jié)核病(Paratuberculosis)是由副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumparatuberculosis)引起的一種反芻動(dòng)物慢性消化系統(tǒng)疾病[1]。該病呈世界性分布，副結(jié)核分枝桿菌可引起感染牛的產(chǎn)奶量下降、持續(xù)性消瘦和頑固性下痢，死亡率可達(dá)2%～10%，給我國養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失。大量研究表明，人的克羅恩病與副結(jié)核分枝桿菌感染有關(guān)，可能是由于奶的巴氏消毒法不能夠完全殺滅該菌，且研究中發(fā)現(xiàn)44%的奶制品中都檢出副結(jié)核分枝桿菌為陽性。近年來該病逐漸引起世界各個(gè)國家的廣泛關(guān)注[2-3]。鑒于副結(jié)核病對(duì)畜牧養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生安全的潛在威脅，該病被國際動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報(bào)的疫病，我國亦將其列為二類動(dòng)物性傳染病。

盡早發(fā)現(xiàn)感染的動(dòng)物并進(jìn)行種群凈化是防控牛副結(jié)核病的主要措施[4]。目前，常用于副結(jié)核分枝桿菌診斷的方法主要包括細(xì)菌的分離培養(yǎng)、皮下變態(tài)反應(yīng)、IFN-γ釋放試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等[5-7]。然而，這些方法普遍存在操作困難、靈敏度低、敏感性差或檢測(cè)周期長的缺點(diǎn)，難以滿足臨床診斷需要。因此，建立準(zhǔn)確、高效、實(shí)用的副結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)技術(shù)，對(duì)于牛羊等反芻動(dòng)物副結(jié)核病的早期診斷、提高我國畜牧業(yè)生產(chǎn)水平具有重要意義。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法作為一種快速檢測(cè)技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)傳染病的病原診斷中。它的原理是在普通PCR體系中加入熒光基團(tuán)，通過監(jiān)控?zé)晒庑盘?hào)強(qiáng)度達(dá)到顯示目的基因擴(kuò)增動(dòng)態(tài)的目的。與普通PCR方法相比，熒光定量PCR技術(shù)具有特異性高、靈敏度強(qiáng)、可準(zhǔn)確定量的優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)建立了檢測(cè)副結(jié)核分枝桿菌F57基因的SYBR Green I染料實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并將其應(yīng)用到臨床樣本的檢測(cè)中，為牛副結(jié)核病的診斷和防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 副結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(C68604)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)督所；滅活結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC 27294)、大腸桿菌O:157、鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、單增李斯特菌等常見微生物核酸樣品均由本課題組保存。

1.2 主要試劑與儀器 10×Taq反應(yīng)緩沖液、dNTPs、PrimeSTAR?HS DNA 聚合酶、pMD18-T Vector及SYBR?PremixExTaq，均購自寶生物工程(大連)有限公司；凝膠純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，均購自O(shè)mega公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司。7500型熒光定量PCR儀，購自ABI公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì) 下載GenBank中牛副結(jié)核分枝桿菌F57基因序列，應(yīng)用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)針對(duì)F57基因的特異性引物P1/P2。上游引物P1：5′-GTAGTGGGAGGCGTACCAGG-3′，下游引物P2：5′-ATTCGATCACGGACTAGACAGG-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為224 bp。本試驗(yàn)所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 參照細(xì)菌DNA提取試劑盒操作說明書提取副結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA。以1 μg細(xì)菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：10×Taq反應(yīng)緩沖液5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，50 μmol/L P1/P2引物各1 μL，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶0.5 μL，補(bǔ)水至50 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后復(fù)延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物回收純化并與pMD18-T載體連接。挑取單菌落與含50 μg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12 h，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。鑒定正確的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 熒光定量PCR的建立和條件優(yōu)化 以pMD-F57質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，將上下游引物加入到反應(yīng)體系中，于ABI 7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。使用矩陣法對(duì)上下游引物進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。選用10、25 nmol/mL和50 nmol/mL的引物濃度進(jìn)行篩選。

1.6 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將1×108拷貝/μL的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋至濃度范圍1×108～1×101拷貝/μL，以其為模板，在最佳反應(yīng)條件下同時(shí)擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)監(jiān)測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 熒光定量PCR的敏感性檢測(cè) 將1×108拷貝/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別以濃度范圍1×108～1×101拷貝/μL的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，進(jìn)行敏感性檢測(cè)。同時(shí)以相同的質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，比較兩者敏感性的差異。

1.8 熒光定量PCR的特異性檢測(cè) 分別以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、大腸桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、單增李斯特菌等常見微生物DNA樣品為模板，使用所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置去離子水為陰性對(duì)照，檢測(cè)所建立熒光定量PCR方法的特異性。

1.9 熒光定量PCR的重復(fù)性檢測(cè) 對(duì)不同梯度濃度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，每個(gè)梯度進(jìn)行3次反應(yīng)，通過組內(nèi)的Ct值變異系數(shù)(標(biāo)準(zhǔn)偏差/重復(fù)值平均數(shù))評(píng)估所建立方法的重復(fù)性。另外，取3份感染了副結(jié)核分枝桿菌的牛的糞便樣品，提取樣本DNA，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，分析該方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性。批內(nèi)重復(fù)：將3份DNA分別設(shè)立3個(gè)重復(fù)，在同一條件下同時(shí)檢測(cè)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)；批間重復(fù)：將3份DNA進(jìn)行3次獨(dú)立的熒光定量PCR檢測(cè)，計(jì)算批間變異系數(shù)。

1.10 副結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR方法與普通PCR方法的比較 隨機(jī)取50份奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)收集的糞便樣品，分別使用本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法和普通PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，比較2種檢測(cè)方法的結(jié)果是否一致。

1.11 臨床樣品的檢測(cè) 收集新疆維吾爾自治區(qū)規(guī)模化牛場(chǎng)中糞便樣品85份，牛乳樣品116份，利用建立的副結(jié)核分枝桿菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行病原檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 副結(jié)核分枝桿菌F57基因的PCR擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以副結(jié)核分枝桿菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增到的目的片段克隆到pMD-18T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-F57。使用EcoR I和SalI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，結(jié)果顯示，pMD-F57可被酶切為2 700 bp和200 bp左右的2個(gè)片段(圖1)。測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，擴(kuò)增得到的F57基因片段與參考序列同源性為100%。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，分光光度計(jì)測(cè)定濃度為510 μg/mL，將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 pMD-F57的雙酶切電泳圖Fig.1 Double enzyme digestion eletrophoresis of pMD-F57M：DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：雙酶切pMD-F57M:DL-2 000 DNA marker;1:Double enzyme digestion of pMD-F57

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的建立和條件優(yōu)化 經(jīng)反復(fù)探索，本試驗(yàn)所設(shè)定的最佳反應(yīng)體系：2×SYBRPremixExTaq緩沖液10 μL，Rox reference dye II 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，模板2 μL，用去離子水補(bǔ)足總體積至20 μL，其中引物的最佳濃度為10 nmol/mL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s(收集熒光信號(hào))，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以10倍梯度濃度稀釋的pMD-F57質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得了檢測(cè)副結(jié)核分枝桿菌的擴(kuò)增曲線(中插彩版圖2)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。結(jié)果顯示，當(dāng)模板濃度為108～101拷貝/μL時(shí)，Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度具有良好的線性關(guān)系，R2值達(dá)到0.999，拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值(x)與Ct值(y)的關(guān)系為y=-3.182x+31.938 4。對(duì)試驗(yàn)中每個(gè)梯度模板的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，8個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的Ct值變異系數(shù)(CV)為0.02%～0.86%。

圖2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-F57的擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curve of standard plasmid pMD-F571：1.0×108拷貝/μL；2：1.0×107拷貝/μL；3：1.0×106拷貝/μL；4：1.0×105拷貝/μL；5：1.0×104拷貝/μL；6：1.0×103拷貝/μL；7：1.0×102拷貝/μL；8：1.0×101拷貝/μL；9：空白對(duì)照1:1.0×108 copies/μL;2:1.0×107 copies/μL;3:1.0×106 copies/μL;4:1.0×105 copies/μL;5:1.0×104 copies/μL;6:1.0×103 copies/μL;7:1.0×102 copies/μL;8:1.0×101 copies/μL;9:Blank control

圖3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-F57的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of standard plasmid pMD-F57

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性檢測(cè) 對(duì)不同梯度濃度的pMD-F57質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所建立的熒光定量PCR方法最低可以檢測(cè)到10個(gè)分子拷貝，而常規(guī)PCR方法在103拷貝/μL時(shí)能勉強(qiáng)觀察到目的條帶(圖4)。表明本試驗(yàn)所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的敏感性比普通PCR高出約100倍。

圖4 常規(guī)PCR檢測(cè)副結(jié)核分枝桿菌的敏感性Fig.4 The sensibility of routine PCR detecting Mycobactium paratuberculosisM：DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：1.0×108拷貝/μL；2：1.0×107拷貝/μL；3：1.0×106拷貝/μL；4：1.0×105拷貝/μL；5：1.0×104拷貝/μL；6：1.0×103拷貝/μL；7：1.0×102拷貝/μL；8：1.0×101拷貝/μL；9：空白對(duì)照M:DL-2 000 DNA marker;1:1.0×108 copies/μL;2:1.0×107 copies/μL;3:1.0×106 copies/μL;4:1.0×105 copies/μL;5:1.0×104 copies/μL;6:1.0×103 copies/μL;7:1.0×102 copies/μL;8:1.0×101 copies/μL;9:Blank control

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性檢測(cè) 用所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)副結(jié)核分枝桿菌、大腸桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、單增李斯特菌等常見微生物DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果均無擴(kuò)增信號(hào)，而質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品有良好的擴(kuò)增，表明該方法具有良好的特異性。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重復(fù)性檢測(cè) 采用本試驗(yàn)所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)3份陽性樣品分別進(jìn)行3孔重復(fù)檢測(cè)，比較Ct值并計(jì)算組內(nèi)變異系數(shù)；同時(shí)，將3份陽性樣品分別進(jìn)行3次檢測(cè)試驗(yàn)，比較Ct值并計(jì)算組間變異系數(shù)。結(jié)果表明(表1)，本試驗(yàn)所建立的熒光定量PCR方法的組內(nèi)變異系數(shù)低于0.31%，組間變異系數(shù)低于0.79%，該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 熒光定量PCR檢測(cè)的重復(fù)性試驗(yàn)Table 1 The reproducibility test of the established real-time PCR

2.7 副結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR與普通PCR方法的比較 分別采用本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法與普通PCR方法對(duì)隨機(jī)選取的50份牛糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，熒光定量PCR和普通PCR分別檢出5份和4份陽性，陽性結(jié)果符合率為80%，表明本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法具有較高可信度。

2.8 副結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用 采用本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行副結(jié)核分枝桿菌感染情況調(diào)查。從對(duì)新疆維吾爾自治區(qū)8個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)收集的85份糞便樣品和116份牛乳樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)(表2)。檢測(cè)結(jié)果表明，本地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)存在一定程度的副結(jié)核分枝桿菌感染，需引起相關(guān)部門的足夠重視。

表2 動(dòng)物臨床樣品副結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)Table 2 Detection of Mycobactium paratuberculosis infection in animal clinical samples

3 討論

牛副結(jié)核病主要表現(xiàn)為頑固性腹瀉、進(jìn)行性消瘦，甚至死亡，該病不僅給我國畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)損失，更嚴(yán)重威脅著公共衛(wèi)生安全。目前，治療副結(jié)核病尚無特效的藥物與方法，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并淘汰感染牛群是根除此病的有效方法。副結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，具有較強(qiáng)的環(huán)境抵抗力。感染副結(jié)核后的牛往往具有一個(gè)較長的亞臨床期，后期才表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。副結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)條件要求苛刻，操作難度較高。因此，建立一種簡單、高效、快速而又實(shí)用的副結(jié)核病檢測(cè)方法，對(duì)該病的診斷，尤其是早期診斷具有重要意義。

近年來，熒光定量PCR方法被廣泛應(yīng)用于病原微生物的快速診斷及定量檢測(cè)過程中。與常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR具有靈敏度高、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、準(zhǔn)確定量的優(yōu)勢(shì)。熒光定量PCR所擴(kuò)增的基因片段必需要有適宜的長度和良好的特異性，因此，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要。目前，國內(nèi)外已有多項(xiàng)建立副結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的報(bào)道，大部分方法以IS900序列作為檢測(cè)的靶基因[8-9]。IS900序列在副結(jié)核分枝桿菌基因組中以多拷貝形式存在，因此將其作為檢測(cè)靶基因可以大大提高檢測(cè)的敏感性。然而，近年來越來越多的研究表明，某些非結(jié)核分枝桿菌中同樣存在IS900序列，兩者之間同源性極高[10]。這提示當(dāng)以IS900作為靶基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎地解釋檢測(cè)結(jié)果。F57基因是副結(jié)核分枝桿菌獨(dú)有的單拷貝基因，該基因在不同種屬的副結(jié)核分枝桿菌中具有顯著不同，可有效區(qū)分結(jié)核分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌及其他禽分枝桿菌[11]。

本試驗(yàn)所建立的針對(duì)F57基因的熒光定量PCR檢測(cè)方法能特異鑒定副結(jié)核分枝桿菌，與結(jié)核分枝桿菌及其他常見病原微生物無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性；該方法最低能檢測(cè)到10個(gè)拷貝，具有較高的靈敏性。此外，將本試驗(yàn)所建立的熒光定量PCR方法與普通PCR方法結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，該方法具有較高的可信度和靈敏度。整個(gè)熒光定量PCR操作僅需約1 h，檢測(cè)全程在1個(gè)工作日內(nèi)可以完成，適合應(yīng)用于快速檢測(cè)診斷，具有較高應(yīng)用價(jià)值。

目前，國內(nèi)關(guān)于牛副結(jié)核病的研究逐漸得到重視，已有多項(xiàng)關(guān)于牛副結(jié)核病的流行病學(xué)調(diào)查的研究報(bào)道。藺曉月報(bào)道山東省部分規(guī)?；?chǎng)的牛副結(jié)核血清抗體平均陽性率為4.61%[12]。高?；鄣葘?duì)寧夏奶牛養(yǎng)殖區(qū)的9個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)采集1 796份血清樣本，檢測(cè)結(jié)果顯示，各場(chǎng)陽性率在1.78%～15.15%，樣品血清平均陽性率為4.29%[13]。

為了解新疆地區(qū)規(guī)模化牛場(chǎng)的副結(jié)核病感染情況，本試驗(yàn)從新疆地區(qū)8個(gè)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中，收集了85份糞便樣品和116份牛乳樣品，使用本試驗(yàn)建立的熒光定量PCR方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行副結(jié)核分枝桿菌感染情況調(diào)查。檢測(cè)結(jié)果顯示，新疆地區(qū)規(guī)?；?chǎng)糞便陽性率為9.41%，奶樣陽性率為5.17%，糞便樣本的病原檢出率略高于奶樣。流行病學(xué)調(diào)查顯示，新疆地區(qū)規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)存在一定程度的副結(jié)核分枝桿菌感染，有關(guān)部門應(yīng)當(dāng)采取有效措施，控制牛副結(jié)核病的流行。