定量核磁共振氫譜測定氘代碘甲烷的氘代率

王瑜亮，萬新煥，張云云，肖童，李福偉，高紅梅，劉桂娟，林云良*

(1.齊魯工業大學(山東省科學院)山東省分析測試中心，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；3.濟南美高生物醫藥科技有限公司，山東 濟南 250119)

自20世紀30年代核磁共振現象被發現以來，科學家們對其的研究就從未停止。作為一項現代儀器分析技術，核磁共振波譜主要應用于醫學、藥學、生物學、食品、化工、農藥等領域，尤其是在有機化合物的結構確證方面具有無可替代的作用，目前已廣泛應用于小分子及大分子結構和濃度的測定[1]。基于“核磁共振信號強度(I)與激發核(N)的數量成正比”這一原理[2]，核磁共振方法可應用于定量實驗。早在1963年，就有學者利用定量核磁共振技術分析了制劑中阿司匹林、非那西丁和咖啡因的比例[3]。近年來，定量核磁共振技術應用越發廣泛，例如藥品含量測定[4～5]、中藥材質量控制[6]、食品成分檢測[7]、化工中間體定量分析[8]以及標準物質的含量測定[9]等。

碘甲烷是有機合成中常用的甲基化試劑，常常作為有機化合物的生產原料。而碘甲烷被氘代后，可作為氘代標記試劑，用來合成某些化合物或新藥，例如有學者利用氘代碘甲烷合成藥物吡羅昔康-d3[10]。因此，氘代碘甲烷的氘代率對其后續產物的成敗至關重要，但是通過文獻檢索，發現近年來關于化合物氘代率檢測的報道較少[11～13]。

本文就氘代碘甲烷的氘代率檢測方法進行研究，采用定量核磁共振氫譜，加入內標物比對，測定氘代碘甲烷中殘留的氫信號，從而計算氘代率。定量核磁共振法的優點是不需要自身對照品，且樣品前處理過程較簡便[1]，因此將其應用于氘代化合物的氘代率測定尤為合適。本方法準確可靠、簡便快捷，能夠滿足實驗室中氘代碘甲烷的氘代率測定，可以應用到企業的產品檢測、生產過程中的質量控制以及化學反應過程的監控當中。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

Bruker Avance Ⅲ HD 400MHz核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；XPR205型十萬分之一天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；20～200 μL移液器[大龍興創實驗儀器(北京)有限公司]。

1.2 試劑

氘代碘甲烷[MG20715批，氣相色譜/火焰離子化檢測器(GC/FID)方法測定的質量分數為99.70%；MG20716D批，GC/FID方法測定的質量分數為99.72%；MG20719B批，GC/FID方法測定的質量分數為99.71%；以上3批均來自濟南美高生物醫藥科技有限公司]；對苯二甲酸二甲酯(質量分數為99.9%，Dr Ehrenstorfer GmbH公司)；氘代二甲基亞砜(DMSO-d6，氘代度99.9%，體積分數為0.03% 的四甲基硅烷，Cambridge Isotope Laboratories公司)。

2 方法與結果

2.1 實驗條件

2.1.1 供試品溶液的配制

精密稱取對苯二甲酸二甲酯11.77 mg，置10 mL容量瓶中，加DMSO-d6使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為內標物貯備液(1.177 mg/mL)，備用。

精密移取氘代碘甲烷0.2 mL、內標物貯備液0.2 mL，置5 mm核磁管中，加入DMSO-d60.2 mL振蕩混勻，作為供試品溶液。

2.1.2 定量核磁共振實驗參數

采用Bruker核磁共振波譜儀，使用zg脈沖序列(90°脈沖)，于24 ℃下進行核磁分析。實驗參數：譜寬(spectral width，SWH)為4 807.69 Hz；激發偏置(transmitter frequency offset，O1)為2 000.65 Hz；弛豫延遲時間(delay time 1，D1)為65 s；脈沖寬度(Pulse 1，P1)為11.80 μs；空掃次數(number of dummy scans，DS)為2，掃描次數(number of scans，NS)為16，采樣時間(Acquisition time，AQ)為6.82 s，窗函數(line broadening for em，LB)為0.3 Hz。

2.2 氘代率計算公式

氘代率為分子中氫原子被氘原子取代的百分率。本文采用摩爾分數進行計算，用實際的氘原子摩爾數除以全部理論氘原子摩爾數獲得氘代率。在實際氫譜測試中，氘代碘甲烷的殘留氫信號為5重峰，系2個氘原子對氫原子耦合裂分產生，因此樣品中殘留的非全氘物質為CHD2I，因此我們只需要測出樣品中CHD2I的質量，即可計算氘代率。如式(1)～(2)。

(1)

(2)

式中，W2為二氘碘甲烷的質量(mg)；Ws為內標物質量(mg)；Wx為待測物的質量(mg)；Ms為內標物分子量(194.19)；M2為二氘碘甲烷分子量(143.95)；M3為氘代碘甲烷分子量(144.96)；As為內標物峰面積；A2為二氘碘甲烷峰面積；hs為內標峰理論氫數；h2為二氘碘甲烷理論氫數。

2.3 氘代試劑及內標物的確定

定量核磁共振實驗在氘代溶劑的選擇上，應滿足對待測樣品和內標物均有較好的溶解度，同時應考慮溶劑峰與待測物峰、內標物定量峰不發生干擾或重疊。在內標物的選擇上，應考慮采用純度高、易于稱量、不與待測物質相互作用、易溶于氘代試劑、定量峰與鄰近峰信號不干擾的化合物[14]。本文考察了氘代三氯甲烷(CDCl3)與DMSO-d6兩種氘代溶劑，選擇對苯二甲酸二甲酯作為內標物，發現CDCl3、DMSO-d6對氘代碘甲烷、內標物均能較好的溶解，但CDCl3密度大、易揮發，精密移取操作比DMSO-d6困難，故最終確定DMSO-d6為氘代試劑。按氫譜條件測定譜圖，內標定量峰與待測峰分離良好，其中，各峰兩兩之間最小分離度為15.3，完全滿足定量要求。本文選擇δ8.07處信號作為內標峰，δ2.16處信號為待測峰進行計算。供試品溶液1H-NMR圖譜如圖1所示。

圖1 供試品溶液1H-NMR圖譜Fig.1 1H-NMR spectrum of the test solution

2.4 供試品制備方法的確定

因氘代碘甲烷沸點低，極易揮發，較難準確稱量，故在控制室溫(25.0±0.5)℃的條件下，精密量取固定體積，再乘以25 ℃時的密度2.329 mg/μL來獲得氘代碘甲烷的重量，通過此方式減小取樣誤差。另外，由于氘代碘甲烷中殘留的氫質量分數很低，為了使二氘碘甲烷峰與內標峰面積基本一致，降低積分誤差，故內標物的濃度不宜太大，而極少量的內標物稱量又存在較大的稱量誤差，故選擇將內標物配制成一定濃度的貯備液，每次量取固定體積來配制供試品溶液。

2.5 儀器參數的考察

定量核磁共振的儀器參數對結果至關重要，只有合理的參數才使得結果具有準確性。首先我們確定了90°脈沖角度(zg)作為測定脈沖，因為該角度可在xy平面上產生可檢測的最大磁化強度。其次，儀器的延遲時間D1值需大于化合物弛豫時間T1值的5倍，此時該化合物中有99.3%的高能態核回到低能態，達到平衡[2]。本實驗采用Bruker質子反轉-恢復T1方法，選擇脈沖序列t1ir，T1 delay設置為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6、51.2 s，測量供試品溶液中各峰的T1值，結果各峰T1值均小于13 s，如表1所示，因此我們設定D1值為65 s。另外，掃描次數NS可決定圖譜的信噪比S/N，NS越大信噪比越好，但檢測時間也越長，本文考察NS在16、32、64、128次條件下各峰信噪比，結果在NS為16時，圖譜中δ8.07、δ3.89、δ2.16處信號的信噪比均大于300，完全滿足《歐洲藥典》中定量核磁檢測信噪比≥150的要求[15]，為節約測定時間選擇NS為16次。

表1 氘代碘甲烷與內標物各峰的T1值Table 1 T1 value of each peak of iodomethane-d3 and internal standard

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關系考察

精密移取氘代碘甲烷0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mL，分別置5支5 mm核磁管中，每支核磁管中分別加入內標物貯備液0.2 mL、DMSO-d60.2 mL振蕩混勻，作為線性溶液1～5。按2.1.2項下實驗條件測定1H-NMR譜，記錄積分面積，以供試品δ2.16處峰面積與內標物δ8.07處峰面積比值作為縱坐標，以供試品與內標物質量比為橫坐標，做線性回歸，回歸方程為：y=0.001x+0.134 1，R=0.999 0，結果表明，氘代碘甲烷與內標物質量比在1 187.26～2 770.26線性關系良好。如表2所示。

表2 氘代碘甲烷與內標物線性關系表Table 2 Linear relationship between iodomethane-d3 and internal standard

2.6.2 儀器精密度

采用2.1.1項下方法配制1份供試品溶液，按2.1.2項下實驗條件，連續進樣6次，測定1H-NMR譜。以內標物δ8.07峰計算，非氘代率(100%-氘代率%)均值為0.101%、相對標準偏差(RSD)為0.52%，表明儀器的精密度良好。

2.6.3 重復性

精密移取氘代碘甲烷0.16 mL(供試品濃度的80%)各3份、0.20 mL(供試品濃度的100%)各3份、0.24 mL(供試品濃度的120%)各3份，分別置9支5 mm核磁管中，每支核磁管中分別加入內標物貯備液0.2 mL、DMSO-d60.2 mL振蕩混勻，作為重復性溶液1～9。按2.1.2項下實驗條件，測定重復性溶液的1H-NMR譜，以內標物δ8.07峰計算，氘代碘甲烷的非氘代率均值為0.100%、RSD為2.83%，表明本品氘代率測定方法重復性良好。

2.6.4 靈敏度

精密移取氘代碘甲烷適量，用DMSO-d6逐級稀釋制成一定濃度的溶液，按2.1.2項下實驗條件測定1H-NMR譜，使得二氘碘甲烷峰信噪比約為10和3時，即獲得氘代碘甲烷測定的定量限、檢測限濃度。如表3所示。

表3 氘代碘甲烷靈敏度實驗表Table 3 Sensitivity of iodomethane-d3

根據《中國藥典》2020版四部通則要求[14]，當信噪比為3或2時相應的濃度為檢測限，當信噪比為10時相應的濃度為定量限。本文以氫譜圖的信噪比為3～5時確定檢測限，以信噪比為10～15時確定定量限。表明該方法下氘代碘甲烷氘代率測定的最低濃度可以達到6.807 mg/mL。

2.6.5 穩定性

采用2.1.1項下方法配制供試品溶液，按2.1.2項下實驗條件，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后，測定1H-NMR譜。以內標物δ8.07峰計算非氘代率，將各結果與0 h相比，最大變化率為3.92%，表明供試品溶液在12 h內穩定。如表4所示。

表4 氘代率檢測穩定性實驗表Table 4 Stability of deuteration rate detection

2.6.6 耐用性

采用2.1.1項下方法配制供試品溶液，以2.1.2項下實驗條件作為標準條件，在此基礎上調整儀器參數，測定1H-NMR譜。各條件下的譜圖經考察，內標峰與待測峰的信噪比均大于300，滿足定量要求。以內標物δ8.07峰計算非氘代率。結果表明本文方法耐用性良好。如表5所示。

表5 氘代率檢測耐用性試驗表Table 5 Durability of deuteration rate detection

2.7 圖譜處理方法

選取氘代溶劑DMSO-d6中的四甲基硅烷峰作為0點定標，在全譜寬范圍執行自動相位校正、自動基線校正，使得峰左右對稱，基線平整。對參與計算的各峰進行積分，積分范圍包括“目標峰的2個碳衛星信號之間的整個區域”，重復積分5次，峰面積RSD小于1%時取平均值。

2.8 典型樣品的氘代率測定

采用本文既定方法，對三批典型樣品進行氘代率測定，重復測定3次取平均值，結果分別為99.90%(MG20715批)、99.88%(MG20716D批)、99.87%(MG20719B批)。

2.9 討論

有關氘代化合物的表征方法有很多，如紅外光譜法、拉曼光譜法、質譜法、核磁共振波譜法、燃燒-分光光度法等，但實際可用于氘代率計算的方法卻不多。其中，核磁共振方法應用最多，例如“相對質量校正因子法”“1H-NMR與2H-NMR共同測定方法”[13]。前者需要待測物質的標準品，且需測量校正因子；后者需要進行氫譜與氘譜兩種實驗，且需要高純非氘代試劑。相比而言，本方法無需待測物自身標準品，前處理過程方便，僅需一次檢測即可獲得結果。

關于氘代率的計算公式，有文獻報道在計算DMSO-d6的氘代率過程中，將氫譜圖中的定量峰以二甲基亞砜(CH3SOCH3)形式進行計算[12]，但在實際化學反應中，殘留下的幾乎不可能是完全沒有被氘代的物質。另外，通過理論計算發現，以質量計算氘代率和以摩爾數計算氘代率結果也存在一定差異，按照氘代率的嚴格定義，應當使用摩爾數計算氘代率。因此，本文將氘代碘甲烷的非氘物質確定為CHD2I，并以氘原子的摩爾數計算氘代率。

本實驗選取內標物的苯環氫(δ8.07)進行氘代率計算，另外還考察了用內標物的甲基氫(δ3.89)進行計算的結果。結果表明，兩種選峰方式的氘代率基本一致，但以甲基峰計算時，個別實驗結果稍偏高0.01%，推測可能是由于甲基峰距離體系中δ3.2水峰較近，導致基線略微偏高、積分面積稍偏大，最終帶入公式計算后氘代率偏高。因此以內標物的苯環氫(δ8.07)進行計算，所得結果更為準確。

此外，本方法學考察過程中選擇了非氘代率(100%-氘代率)作為統計學指標，可以更加真實地反映實驗方法中“二氘碘甲烷峰面積÷內標物峰面積”與取樣量的關系，對實驗結果的評估也較為合理。

3 結論

本文通過對溶劑進行篩選，確定了DMSO-d6為氘代試劑、對苯二甲酸二甲酯為內標物的核磁方法，并優化了D1、NS等儀器參數，最終確定D1為65 s、NS為16次，并參考《中國藥典》2020版四部“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”進行了方法學驗證，建立了氘代碘甲烷的氘代率測定方法，同時還對幾批典型樣品進行了氘代率檢測，表明定量核磁共振氫譜適用于氘代碘甲烷的氘代率分析。該方法操作便捷，耗時較短，能夠滿足實驗室中氘代碘甲烷氘代率的檢測。另外，該方法的開發為定量核磁共振實驗拓寬了應用范圍，也為其他氘代化合物氘代率測定提供了一個思路。