射干-麻黃配伍治療咳嗽變異性哮喘的分子機制探索

梅偉英，陸煒青，陳韞煒，梅文星，申春悌

(常州市中醫醫院 呼吸科，江蘇 常州 213000)

咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)是以慢性或頑固性咳嗽為特征的呼吸系統常見疾病，其發病機理主要為持續氣道高反應性及炎性反應，灰塵、冷空氣、油煙等為常見發病誘因，CVA是兒童與成人慢性咳嗽的主要類型[1-2]。目前CVA的臨床治療以支氣管擴張劑、糖皮質激素、白三烯受體拮抗劑及擴張支氣管平滑肌、改善氣道痙攣作用的藥物為主，但此類藥物長期使用存在毒副作用，且停藥后易復發[3]。

中醫藥治療注重辨證論治、標本兼治，在改善癥狀、減輕西藥毒副作用、提高生活質量等方面具有獨特的優勢，在CVA的臨床治療中被逐漸重視。CVA在中醫學屬“咳嗽”“哮喘”“久咳”等范疇，臨床治療常從祛風滌痰、宣肺化飲等著手。江蘇省名中醫申春悌教授在中醫藥治療肺系疾病方面積累了豐富經驗，其臨床治療咳喘常以祛風化痰為法，擅長使用射干、麻黃配伍治療CVA。中藥射干，為鳶尾科植物射干的干燥根莖，味苦性寒，入肺經；麻黃，為麻黃科麻黃屬植物的草質莖，性溫味辛微苦，入肺與膀胱經。射干、麻黃配伍為《金匱要略》主治寒痰郁肺之咳喘的射干麻黃湯中的君藥，“咳而上氣，喉中水雞聲，射干麻黃湯主之”，具有溫肺化飲、下氣祛痰之功效。射干與麻黃在現代咳嗽、哮喘等呼吸系統急性病的中醫藥治療中被廣泛配伍應用[4]。研究表明，射干、麻黃配伍治療CVA具有明確療效[5]，但其藥效物質基礎、分子機制等目前尚未明確。

本研究擬借助網絡藥理學方法，立足中醫藥辨證論治理論，結合申春悌教授臨床經驗，通過篩選，預測射干、麻黃活性成分治療CVA的可能作用靶點基因，預測其參與的生物學過程與信號通路，嘗試探究其潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 射干-麻黃活性成分篩選及作用靶點預測

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)分別收集中藥射干(Belamcandae Rhizoma)、麻黃(Ephedrae Herba)的活性成分，以中藥的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)>30%、類藥性(drug like，DL)>0.18為藥動學(ADME)篩選條件[6-8]，篩選獲得射干、麻黃有效活性成分，并下載相關成分的TCMSP疾病預測靶點。

1.2 CVA靶點基因收集

以“cough variant asthma”為主題詞在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)檢索目前公認的CVA疾病靶點基因，下載靶點信息進行整理。

1.3 射干-麻黃調控CVA的藥物-靶點網絡構建

將預測的射干-麻黃有效活性成分作用疾病靶點，與GeneCards獲得的CVA疾病靶點導入R軟件中，對靶點信息取交集，獲得射干-麻黃活性成分直接作用的CVA疾病靶點，并與射干-麻黃有效活性成分共同導入至生物醫學網絡可視化工具CytoScape軟件中，以中藥名稱、活性成分、CVA靶點為網絡節點(Node)，關聯關系為邊線(Edge)[9]，構建射干-麻黃活性成分調控CVA的藥物-靶點網絡。

1.4 目標靶點基因蛋白質-蛋白質相互作網絡構建分析

將獲得的射干-麻黃有效活性成分作用的CVA疾病靶點基因上傳至String數據庫(https://string-db.org/)，選擇物種為人類(Homo Sapiens)，進行靶點基因的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析，構建PPI網絡。

1.5 目標靶點基因本體與KEGG信號通路富集分析

使用R軟件Bioconductor生物醫學分析工具包對獲得的射干-麻黃有效活性成分作用的CVA疾病靶點基因進行基因本體(gene ontology，GO)[10]和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[11]信號通路富集分析，并對結果進行可視化，預測目標靶點基因可能參與的生物學功能注釋過程與分子信號通路，以p<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 射干-麻黃有效活性成分與作用疾病靶點收集

通過TCMSP平臺共檢索獲得射干活性成分56個、麻黃活性成分363個，根據研究設定的OB>30%、DL>0.18藥動學標準對射干-麻黃活性成分進行篩選，剔除兩藥物的共有成分后，獲得射干-麻黃有效活性成分30個，預測疾病靶點基因110個，結果如表1所示。

2.2 射干-麻黃調控CVA疾病靶點基因獲取

從GeneCards數據庫檢索獲得CVA疾病靶點基因2083個，與上述獲得的射干-麻黃有效活性成分作用疾病靶點基因110個進行取交集計算，最終獲得射干-麻黃活性成分調控CVA目的靶點基因75個，結果以維恩圖呈現，見圖1。

圖1 射干-麻黃活性成分調控CVA目的靶點基因Fig.1 Venn diagram of the GeneCards cough-variant asthma targets and targets of Belamcandae Rhizomea-Ephedrae Herba couple medicine

2.3 射干-麻黃活性成分-CVA靶點基因調控網絡

將2.2節篩選獲得的射干-麻黃有效活性成分與其調控的CVA疾病靶點基因信息導入至CytoScape軟件中，構建射干-麻黃活性成分-CVA靶點基因調控網絡。如圖2所示，麻黃、射干與各自有效活性成分及CVA疾病靶點基因通過邊線相連接構成網絡，靶點基因中PTGS1、NCOA2分別與25、21個射干-麻黃有效活性成分相聯系，受到多個活性成分的直接調控作用，為靶點基因中度值(degree)最高的2個基因；中藥活性成分中山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、毛地黃黃酮(luteolin)等與較多CVA靶點基因存在直接聯系，可能是射干-麻黃發揮重要藥理學作用的主要成分。

2.4 目標靶點基因PPI網絡分析

將獲得的75個射干-麻黃調控的CVA靶點基因上傳至String數據庫進行PPI分析，結果如圖3所示。75個目標靶點基因編碼的蛋白彼此通過邊線相連接形成網絡，每一條邊線代表相應基因編碼的蛋白間存在生物學功能互相作用的關系。網絡分析結果顯示，度值為18.5，局部聚類置信度為0.612，未形成局部聚類，僅形成單一網絡聚類。

將String數據庫的PPI分析結果下載保存，導入至CytoScape軟件重新構建目標靶點基因編碼的蛋白之間的PPI網絡，使用CytoHubba插件對PPI網絡中的節點進行度值計算分析，獲得在該網絡中度值最高的10個關鍵蛋白，編碼該蛋白的基因則為射干-麻黃活性成分調控CVA的關鍵基因，結果見圖4。CytoHubba從射干-麻黃活性成分調控的75個目標靶點基因中篩選獲得了10個關鍵基因，排名為：IL6、VEGFA、EGFR、CASP3、MAPK8、CCND1、ESR1、MYC、FOS、RELA。

圖4 關鍵基因排名結果Fig.4 Ranking of the hub genes

2.5 目標靶點基因GO與KEGG分析

將獲得的射干-麻黃活性成分調控的CVA靶點基因整理，導入至R軟件，運行Bioconductor工具包進行GO生物學過程富集分析與KEGG信號通路富集分析。GO富集分析結果顯示，75個目標靶點基因共富集于98個具有統計學差異(p<0.05)的GO生物學過程，根據P值從小到大進行排列，主要生物學過程包括核受體活性、直接配體調控序列特異性DNA結合的轉錄因子活性、泛素樣蛋白連接酶結合、甾體激素受體活性、類固醇結合等。KEGG信號通路富集分析結果顯示，靶點基因共富集于215條KEGG信號通路，其中110條經檢驗具有統計學差異(p<0.05)，按照P值從小到大排列，排名前5位的是PI3K-Akt信號通路、腫瘤中的微小RNA、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、人類巨細胞病毒感染。分別將GO與KEGG富集分析結果可視化呈現，結果見圖5～6。

圖5 目標靶點基因GO富集分析Fig.5 Gene ontology enrichment analysis of the target genes

圖6 目標靶點基因KEGG富集分析Fig.6 Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway enrichment analysis of the target genes

3 討論

CVA常因冷空氣、灰塵等因素誘發，導致患者出現持續或陣發性的干咳，難以停止。兒童CVA治療不當、不及時可能進一步發展為典型哮喘發作，CVA嚴重影響患者的日常生活質量。中醫藥治療立足整體觀念與辨證論治，具有簡便廉驗的特點，在CVA的臨床治療中與西藥配合，能夠發揮出良好的功效。

本研究立足于射干-麻黃配伍辨證治療CVA，借助網絡藥理學與生物信息學理論方法及在線分析工具，對其有效活性成分調控CVA疾病靶點基因的關系網絡及潛在分子機制展開探索。首先根據中藥口服生物利用度、類藥性等藥動學原則，從TCMSP平臺篩選獲得射干-麻黃有效活性成分30個，對應不同疾病靶點110個；從GeneCards疾病靶點數據庫篩選獲得CVA的疾病靶點基因，經過取交集處理得到射干-麻黃活性成分可能產生直接調控作用的CVA疾病靶點基因75個；將上述獲得的射干-麻黃有效活性成分與目標靶點基因進行調控網絡關系構建分析。從網絡中可知，射干-麻黃的多個不同有效活性成分分別與多個不同的CVA靶點基因相聯系，而同一個靶點亦可能同時受到多個不同活性成分的作用，提示射干-麻黃治療CVA的多成分、多靶點、網絡調控特點。

靶點基因是藥物活性成分發揮調控作用的關鍵對象。從目標靶點基因編碼蛋白的PPI網絡關系可見，獲得的75個目標靶點基因彼此均存在密切聯系，網絡中無分散的聚類產生，平均每個靶點基因的度值為18.5，提示彼此之間平均與18個以上的不同靶點基因相聯系，共同發揮重要的生物學功能作用。進一步通過CytoHubba插件分析計算PPI網絡中基因的度值大小，篩選出網絡中度值最高的10個關鍵基因。靶點基因中C反應蛋白(CRP)、花生四烯酸5-脂加氧酶(ALOX5)、關鍵基因白介素6(IL6)等是已經發現的重要炎癥因子，在大量相關炎癥反應中被廣泛研究；關鍵基因血管內皮生長因子(VEGFA)、表皮生長因子受體(EGFR)等廣泛參與氣道重塑并與炎癥細胞的募集相關；關鍵基因雌激素受體1(ESR1)、核受體輔活化子2(NCOA2)等則是參與多種受體激活活動反應的重要因子。靶點基因彼此聯系，在不同的信號通路中發揮獨特的生物學功能。射干-麻黃有效活性成分可能通過調控CVA目標靶點基因，發揮對多個與CVA發病病理機制相關的信號通路的介導調控作用，從而達到治療的目的。

從目標靶點基因的GO生物學過程、KEGG信號通路富集分析結果來看，射干-麻黃活性成分調控的75個CVA靶點基因共富集于98個生物學過程、110條信號通路，涉及氣道炎癥反應與氣道高反應性調控、自身免疫反應、病毒感染、類固醇激素受體結合活動等CVA病理與治療相關過程。氣道炎癥反應與氣道高反應性是CVA發病的重要環節，CRP、IL6等炎癥因子水平在CVA發病中顯著升高，糖皮質激素對氣道局部炎癥反應的抑制作用顯效明顯[12]，射干-麻黃配伍的方劑治療CVA研究中發現CRP、IL4等炎癥因子水平明顯下降[13]，靶點基因富集于類固醇結合、甾體激素活性等過程，提示射干-麻黃有效活性成分可能通過調控IL3、IL6等炎癥因子信號通路發揮抑制局部炎癥、發揮類糖皮質激素作用。目前臨床常以β受體激動劑、白三烯受體拮抗劑等藥物擴張支氣管平滑肌、緩解氣道痙攣治療CVA，研究表明麻黃堿等成分可能通過ALOX5等靶點基因參與的白三烯受體相關通路調節內質網應激反應以減輕氣道反應性[14-15]。機體免疫調節是CVA發病的另一個關鍵點，有研究認為類似過敏反應為機體免疫功能的異常表現，目的靶點基因富集于CD8+T細胞調節通路、自身免疫系統等信號通路，提示射干-麻黃活性成分可能通過調節機體免疫反應調控CVA的病理發生，亦有研究表明麻黃成分可改善機體免疫功能[16]。皰疹病毒、巨細胞病毒等感染是呼吸系統疾病的常見病因，病毒感染可誘發機體免疫反應及炎癥反應，不少CVA反復發作的病因即為呼吸系統的慢性病毒感染所致[17]，射干-麻黃活性成分參與調控病毒感染相關相號通路，可能是CVA病理機制研究的新方向。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學理論方法，揭示了射干-麻黃配伍治療CVA潛在的有效活性成分-疾病靶點調控網絡，并預測目標靶點基因可能參與的相關生物學過程與信號通路。研究結果提示射干-麻黃治療CVA存在多成分、多靶點、多信號通路、多生物學過程的復雜網絡調控機制特點，提出射干-麻黃可能通過抑制氣道炎癥反應與高反應性、調節自身免疫功能、干預病毒感染活動等環節發揮治療作用的觀點，希望能為后續具體實驗研究提供方向。