表面增強拉曼光譜在乳和乳品有害物質檢測中的研究進展

桑潘婷，郭亞輝, ，張倩瑤，成玉梁，于 航，謝云飛，姚衛蓉，錢 和

（1.江南大學食品學院，江蘇無錫 214122；2.桐廬縣檢驗檢測中心，浙江杭州 311500）

乳是一種營養全面近乎完美的食品，被稱為“白色血液”，是酸奶、奶酪、冰淇淋等眾多受歡迎乳制品的主要原料，對保障國民健康和增強國民體質具有不可替代的作用。另一方面，在乳品產業快速發展的同時，由養殖、流通及加工制造過程中引入的有害物質如農獸藥殘留[1?2]、真菌毒素[3?4]、重金屬以及非法添加等，對民眾的生命健康造成了潛在安全風險。2008年我國嬰兒奶粉中的三聚氰胺污染導致300000人患病，50000名嬰兒住院治療，6例死亡病例，經濟損失巨大，嚴重影響了消費者對乳品產業的信心。

乳及乳制品中有害物質常見的檢測方法包括化學反應法[5]、微生物法[6]、免疫分析法[7?8]和儀器分析法[9?10]。其中，化學反應法和微生物法由于靈敏度較低，一般用于定性或半定量檢測。而免疫分析法由于其便捷性，應用較為廣泛，主要有試紙條和ELISA試劑盒等產品。此類方法檢測時間短，成本較低，可應用于牛奶中多種有害物質的檢測[11?12]，但一般根據肉眼觀察得出結果，因此檢測靈敏度不高，只能用于定性或半定量檢測。高效液相色譜法等儀器分析法雖然靈敏度高，可同時測定多個樣品，但設備昂貴，維護費用較高，而且存在樣品預處理和分析程序復雜，檢測時間長等問題[13]。

拉曼光譜由于其靈敏度高、可無損檢測等優點，近幾年來在食品有害物質檢測中逐漸發展起來。表面增強拉曼光譜（SERS）是作為一種經典的拉曼光譜法，是根據樣品本身的非彈性散射，可以提供幾乎所有分子的結構以及定量信息[14]。它的原理是將具有特殊納米結構的貴金屬，如Au、Ag等作為活性基底，通過放大拉曼信號來定量檢測目標物，因此有望作為一種方便快捷，并且靈敏度高的方法，應用于乳和乳制品中有害物質的檢測。本文就SERS法在乳及乳制品中有害物質的檢測方面的研究做出如下論述。

與傳統的測定技術相比，SERS顯示出許多獨特的優勢，它可以將信號放大到105~106倍，而且具有極高的分子特異性，不依賴于外部染料分子，具有抗光漂白性和抗光降解性的優點，可以重復檢測，信號誤差較小[15]。但大量數據表明，一般物質的拉曼光譜信號較弱，限制了SERS在食品安全檢測領域的應用范圍。實驗證明，利用特殊的SERS檢測探針和基底、分子識別技術以及核酸擴增等其它技術，可以顯著改善拉曼平臺的檢測性能[16]。本文論述了SERS在乳和乳品有害物質檢測中的研究進展及其發展趨勢。

1 基于不同檢測探針和基底的SERS方法

1.1 金屬納米檢測探針

金屬納米顆粒的形態尺寸對SERS信號的增強效果至關重要。傳統的SERS法主要以單金屬納米顆粒作為檢測探針，如AgNPs、AuNPs等。研究表明，AgNPs的拉曼增強效果最明顯，但Ag極易氧化，所以穩定性較低，而AuNPs雖然信號增強效果欠佳，但穩定性顯著高于AgNPs。因此，近幾年新開發出的雙金屬核殼納米顆粒（Au@AgNPs）得到了快速發展，由于其具有AuNPs和AgNPs的雙金屬協同作用，穩定性得到改善，光學性能優異，信號增強作用明顯，被廣泛使用作為拉曼檢測探針。William等[17]通過優化Au/Ag比，合成了一種馬鈴薯發芽狀的Au-Ag雙金屬納米顆粒。當Au/Ag比為10:7時，觀察到的SERS信號強度比10:6的信號強度高出約7倍，推測可能是由于納米顆粒上的尖芽有助于熱點的聚集。為驗證該假設，利用數值模擬技術建立兩種芽尖銳度不同的馬鈴薯狀模型，測定電場強度，根據電磁理論，SERS信號的強度直接取決于納米顆粒的局部電場。結果證實，尖芽引起的電場增強比鈍芽高5倍，而且取向一致并彼此靠近的尖端能夠產生更高的電場增強。

除了經典的金納米球外，金納米棒、金納米星等特殊性形態的納米顆粒也被用于制備SERS檢測探針。金納米棒由于其獨特的各向異性結構可以產生強電磁場，顯著增強了拉曼信號。先前的研究表明，在基板上合成垂直排列的AuNRs單層可作為理想的SERS基底[18]。Mei等[19]在金納米球上沉積垂直取向的金納米棒形成了楊梅狀Au核，然后在核結構上通過還原合成Ag NPs，制備了如圖1所示的3D Au@Ag NP，該結構所產生的熱點使其具有優異的SERS增強能力，增強因子高達3.4×106。另外，改變3D Au@Ag NP上的硫醇配體，可以應用在不同場合，如以NT、PBAT為代表的硫醇配體在特征峰處能夠產生SERS信號，可以用作內標物校準納米顆粒的狀態和測量變化；而基于MEA的納米顆粒顯示空白的SERS信號，可用于孔雀石綠，三聚氰胺的檢測。

圖1 3D Au @ Ag NP[19]Fig.1 3D Au@Ag NP structure[19]

另外，直接合成不規則的特殊形態納米顆粒對于反應條件和操作的要求較為嚴苛，而且納米探針的一致性難以保證。研究發現，可以借助SiO2、Al2O3等材料制備出特定形態的模板，并以其為基底在表面直接反應制備多形態金屬納米顆粒，有助特殊形態的納米探針的合成，并能夠保證產品的一致性。Zhai等[20]以ZnO為模板，通過兩步法制備了可再生的3D角狀ZnO/Ag@Au，用于檢測牛奶中的抗生素，該結構顯著增加了納米顆粒的表面積，SERS增強因子可以達到1.48×109，對牛奶中磺胺吡啶的檢測限低至1×10?9mol/L。而且由于ZnO具有光催化性能，ZnO/Ag@Au可以將磺胺吡啶經紫外降解后回收利用，因此可以滿足現場檢測的需要。

1.2 新型固相SERS平臺

除了改變納米探針的形態外，SERS檢測的平臺也至關重要。一般來說，溶液中的檢測不利于便攜式傳感器的制備，很難滿足乳及乳制品中有害物質高通量、低成本和快速即時的檢測需求。近幾年來，大部分研究集中于制備具有高“熱點”的便攜式固相SERS平臺。如圖2所示為[21]一種基于PS膠體的Au/Ag碗狀結構（BPHAN）。首先在ITO玻璃板上沉積一層金膜，得到Au/ITO基底，吸附上PS單層后，經電沉積并去除PS后獲得Ag BPHAN，經氧化還原反應獲得Au/Ag BPHAN。將該SERS活性平臺用于奶粉中三聚氰胺的快速檢測，檢測限低至0.1 ppm。

為降低檢測成本，Marques等[22]制備了一種用于檢測牛奶中四環素的SERS紙基平臺，該平臺由壓制的纖維層，聚合物涂層和鋁層組成，鋁層頂部存在一層薄的天然氧化物層，解決了AgNP易氧化的問題，在紙基上沉積6 nm的AgNP膜，即可測定牛奶中的四環素含量。該方案檢測成本低，可回收，而且穩定性高，靈敏度低至0.1 ppm。

為提高檢測效率，滿足高通量的檢測需求，可以將SERS與毛細管/移液管相結合，制備微量移液器，從而實現取樣、檢測一步到位。Zhou等[23]利用干燥的羅勒種子與移液管結合形成便攜式設備，由于干燥的羅勒種子具有緊密復雜的纖維狀結構，使得沉積在羅勒種子上的銀納米粒子與包含分析物的牛奶樣品保持緊密接觸，提高了檢測靈敏度，該設備對牛奶中三聚氰胺的檢出限為0.85 μmol/L（0.107 ppm）。此外，微流控與SERS相結合也能夠大大提高檢測效率，Nguyen等[24]以石墨烯和金納米顆粒復合材料為基底，通過生物素-鏈霉親和素作用連接上包含卡那霉素適配體序列的發夾結構，卡那霉素與適配體結合后，發夾結構的兩端被展開，添加帶有納米標簽的光學探針與其中一端雜交，顯示出SERS信號。將該納米感應體系建立在微流控設備上，對牛奶中卡那霉素的回收率為98.9%，檢測限低至0.75 nmol/L。

總之，從單金屬納米顆粒到雙金屬協同作用，從規則的納米球、納米棒到不規則的納米花和納米星，從傳統的固相基底和液體微珠到微流體芯片，再到紙質基質，光纖和疏水性基底，SERS檢測體系的多樣性使得其應用越來越廣泛[25]。這些不同的SERS體系適用于不同的場所和要求，如利用微珠在液相中進行檢測，可以增加反應動力學；而微流體平臺則實現了大量小體積樣品的同時分析；為實現遠程控制現場檢測，光纖基底逐漸興起；另外，紙質基底有利于降低檢測成本；而超疏水性基底被開發用于富集目標分子，具體應用如表1所示。

表1 基于不同檢測探針和基底的SERS方法Table 1 SERS methods based on different enhanced substrates

2 基于不同分子識別技術的SERS方法

目前，SERS技術已經廣泛運用于乳及乳制品檢測中，但是復雜的樣品基質對SERS平臺的目標物富集能力提出了更高的要求，疏水性的基底在一定程度上提高了樣品的富集效果，但大部分平臺在樣品的蒸發過程中，還是會存在釘扎效應，形成大小不一的咖啡環，很難將目標物和納米檢測探針聚集到同一位置，降低了檢測準確度。因此，為提高SERS平臺的樣品富集能力，增強檢測的特異性和靈敏度，在SERS平臺中引入抗體、適配體、分子印跡聚合物等作為識別分子，構建檢測傳感器，有利于目標物更加緊密、牢固地結合在SERS平臺上，改善檢測效果。

SERS-免疫體系主要有兩部分組成，免疫底物以及SERS免疫探針[44]。以非競爭性體系為例，免疫底物被捕獲抗體修飾，用于捕獲分析物，而SERS探針由金屬納米顆粒，拉曼報告分子以及檢測抗體組成，用于特異性識別免疫底物捕獲的分析物，發出SERS信號。如圖3a所示為以芯片為代表的非競爭性夾心結構，目標分子夾在捕獲抗體與SERS探針之間，用于檢測大分子物質，如蛋白質等。圖3b為競爭性SERS-免疫體系，以球狀顆粒為代表，包被抗原被標記作為SERS免疫探針，目標分子與探針競爭結合抗體，檢測信號強度與目標物濃度呈負相關。

圖3 SERS-免疫體系Fig.3 SERS-immuno system

Transformation Heat treatment ED of Ag bowl Removal of PSs Etch by HAuCl4 solution Removal of AgCl

由于高靈敏度，多路復用以及方便快捷等優點，基于SERS的免疫方法在食品監管領域的應用越來越廣泛。目前已經開發了多種免疫自動檢測平臺，如試紙條、微流控芯片等。Yang等[45]提出了一種基于競爭性免疫測定和磁分離技術的用于氯霉素（CAP）殘留檢測的SERS傳感器。以4,4’-DP為拉曼報告分子，在GNPs上偶聯CAP-BSA，作為SERS探針。再在MNPs上修飾CAP抗體，形成antiCAP-MNPs。由于antiCAP-MNPs可同時捕獲游離的CAP和SERS探針，兩者存在競爭性免疫反應。經磁分離富集后，通過測定上清液中的SERS信號，可獲得溶液中CAP的濃度。Shi等[46]制備了一種基于SERS-免疫層析試紙條，其中，免疫探針由新霉素單克隆抗體（NEO-mAb）和拉曼報告分子4-氨基硫酚（4-PATP）標記的SERS納米標簽構成，由于待測樣品中的游離NEO與試紙條上的包被抗原（NEO-OVA）之間存在競爭性免疫作用，因此可以通過測試線上的PATP的拉曼強度獲得新霉素的含量。該方案檢測時間約15 min，對牛奶中新霉素的檢測限為0.216 pg/mL。

適配體作為一種理想的抗體替代物，合成周期遠小于抗體，而且易于修飾，因此逐漸用于構建新型的SERS傳感器[47?49]。如圖4所示為一種以四環素為檢測對象的適配體傳感器[50]，磁性納米顆粒-適配體作為識別單元以提供磁性；cDNA-APS產生拉曼信號，兩者通過適配體與cDNA雜交結合在一起。當加入含有四環素的樣品時，四環素與適配體結合，釋放一定量的cDNA-APS，經過磁分離后，根據上清液的SERS信號，獲得牛奶中四環素的含量。該傳感器顯示出良好的穩定性和可再現性，檢測限為0.001 ng/mL。

圖4 一種磁性適配體傳感器原理圖[50]Fig.4 Schematic diagram of a magnetic adapter sensor[50]

分子印跡聚合物（MIP）不僅具有抗原抗體的特異性識別能力，還具有結構穩定、可預測等優點，因此適用范圍較廣。將SERS與MIP結合應用，基本原理如圖5所示，將模板分子（與目標物結構相似）與功能單體混合形成預聚合物，此時單體通過共價或非共價相互作用圍繞模板分子排列，呈分子聚集體狀。添加交聯劑通過聚合使單體分子交聯后，去除模板分子，留下與模板分子互補的空間結構，可以有選擇地將目標分子捕獲到金屬表面以生成SERS信號[51?52]。Xie等[53]提出了一種MIP-SERS傳感器，用于檢測牛奶中的氯霉素殘留。首先通過沉淀聚合制備MIP，并提取模板分子，然后將該聚合物置于檸檬酸鈉還原反應中以制備CAP-MIP-Au底物，該底物同時具有MIP的良好的吸附能力和SERS增強作用，可直接添加到牛奶樣品中檢測氯霉素的含量，檢出限為0.1 μg/mL。

圖5 MIP-SERS結構Fig.5 MIP-SERS structure

基于免疫的SERS檢測方案目前應用較為廣泛，將免疫法的選擇性與SERS信號表達的高靈敏性結合起來，有利于實現高通量，高選擇性的快速檢測。而適配體由于其易于體外大量合成，穩定性高，相較于抗體，適配體的靶標廣泛，包括農獸藥、毒素等一系列有害物質，而且易于標記，因此也被逐漸用于SERS傳感器的構建。另外，以分子印跡技術為基礎的SERS檢測目前在乳制品中應用較少，有待進一步研究，具體如表2所示。

表2 基于不同分子識別技術的SERS方法檢測乳制品中有害成分Table 2 SERS methods based on different molecular recognition technologies

3 基于信號放大技術的SERS方法

為進一步提高檢測的靈敏度，可以結合聚合酶鏈式反應（PCR）和等溫核酸擴增技術，如重組酶聚合酶擴增技術（RPA）和雜交鏈反應（HCR）等，先將低水平的目標分子擴增到可以檢測的水平，再進行檢測，從而達到放大SERS信號的目的[67?68]。重組酶聚合酶擴增技術（RPA）作為一種等溫核酸擴增技術，在無需熱循環設備的情況下，利用酶高效的催化活性，達到放大信號的目的。Liu等[69]基于AuMBA@Ag探針開發了一種可同時檢測單核細胞增生李斯特菌和腸炎沙門氏菌的免疫試紙條——RPA-LF-SERS試紙條，具體如圖6所示。該試紙條的測試線1被標記上FITC抗體（anti-FITC），測試線2被標記上地高辛抗體（anti-digoxin），對照線上修飾有鏈霉親和素抗體（anti-streptavidin）。RPA首先被用于擴增生物素-Digoxin和生物素-FITC標記的目標DNA，純化后的RPA產物通過生物素-鏈霉親和素作用與AuMBA@Ag結合后，被測試線上對應的抗體捕獲，形成橙黃色的視覺帶。該試紙條對牛奶中腸炎沙門氏菌的檢出限為31 CFU/mL，單核細胞增生李斯特氏菌的檢出限為36 CFU/mL。除了酶輔助的核酸擴增技術外，Lv等[70]基于無酶介導的等溫核酸擴增——雜交鏈反應（HCR），制備出一種超靈敏SERS平臺，用于檢測牛奶中的食源性致病菌。該平臺以單克隆抗體和引發DNA標記的AuNPs作為探針，當目標病原體存在時，探針上的相應引發DNA識別出匹配的發夾結構，觸發特異性雜交，形成多色熒光串聯體作為信號放大器，觀察到相應的熒光。該方法可同時檢測牛奶中的大腸桿菌O157:H7、霍亂沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌，檢測限分別為34、6.4、70 CFU/mL。

圖6 RPA-LF-SERS 試紙條[69]Fig.6 RPA-LF-SERS assay[69]

4 基于其它技術的SERS方法

SERS可以根據分子的結構信息，對化合物進行鑒別，而色譜法對樣品混合物具有良好的分離效果，利用SERS對色譜預處理的分離液進行分析，可以改善樣品中有害組分的檢測效果[71]。Zhao等[72]利用TLC-SERS（薄層色譜-SERS）對1~250 ppm的含有三聚氰胺的牛奶樣品進行薄層色譜分離，再將AuNPs沉積到分離后的濃縮點上，利用便攜式拉曼光譜儀測定SERS光譜，并結合四元數主成分分析法提高定量的準確性，該方法顯示出對牛奶中三聚氰胺的良好檢測性能。

5 總結與展望

目前SERS在乳及乳制品檢測中的大部分應用仍只能在實驗室實施，為使其在乳制品檢測中廣泛應用，需要解決一些難題。首先，乳和乳制品中一般的有害物質拉曼信號較低，以單金屬納米顆粒作為檢測探針的穩定性和靈敏度有待提高，利用雙金屬的協同作用，可以顯著改善信號強度。另外，通過一些易成型的材料形成特殊形狀的基底，以其為模板可以制備出具有較強的電磁場或者豐富“熱點”的理想的金屬納米顆粒。其次，作為一種新興的食品安全檢測技術，拉曼光譜儀的價格昂貴，對于中小型乳制品企業來說，生產成本偏高，可以結合微流控、玻璃毛細管等開發出低成本、高性能的SERS基底，降低成本的同時，可以實現取樣、檢測一體化。

由于SERS平臺的釘扎效應，乳及乳制品中的目標物很難被富集起來并與檢測探針充分作用，除了制備疏水性平臺外，可以引入抗體、適配體和分子印跡聚合物等分子識別技術來捕獲目標物，從而提高檢測的特異性和靈敏度。此外，將免疫與PCR以及一些等溫核酸擴增技術也可以用于乳及乳制品中微量物質的檢測，其中抗體作為捕獲單元用于捕獲目標物，而核酸擴增技術用于放大檢測信號。為防止乳制品的復雜組成產生的基質效應影響到檢測結果的準確性，可以結合色譜技術對樣品進行簡單的分離預處理，再進行SERS檢測。隨著靈敏度、特異性和便捷性等方面的改善，SERS有望成為日常評估乳和乳制品的常規工具。