阿勒泰羊臀脂及其分提產物對小鼠結腸形態及盲腸內容物短鏈脂肪酸影響

朱明睿，于晨晨，徐艷麗，張 莉，孫佳寧，鄧香娟，王子榮

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）

我國屬于羊肉消費大國，新疆作為羊肉生產和消費大省，2018年綿羊出欄數高達3677.8萬只[1]。新疆肉羊以脂臀羊居多，該品種肉質較好且臀部脂肪含量非常高[2]。阿勒泰羊作為新疆地區優質的脂臀羊品種之一，其脂肪沉積豐富，尾臀部脂肪可占胴體重量的20%[3]。已有研究人員對羊臀脂某些營養特性進行了初步研究，李濤等[4]和劉丹等[5]發現阿勒泰羊臀脂和哈薩克羊臀脂都符合人類健康性食用的標準，何鑫等[6]發現阿勒泰羊臀脂中不飽和脂肪酸占比49.30%。由此可見，羊臀脂營養價值較高，但目前相關研究較少，針對羊臀脂營養特性有待于開展更深入的研究。

溶劑法分提能改變油脂中脂肪酸的組成，得到營養價值不同的油脂[7]。張曉鵬等[8]將豬油經過溶劑法分提后，得到了富含結構脂的液脂，并以此為原料開發人乳替代脂肪。沈繼紅等[9]通過溶劑分提技術分離了魚油中高凝固點組分，結果表明該法能有效提高魚油中液態油脂含量，并且提高分提產物中多不飽和脂肪酸含量。因此，研究油脂分提產物的營養特性能夠為后續功能性油脂的開發利用提供理論基礎。

前人研究發現，膳食脂肪的攝入會對宿主體內腸道菌群及其代謝產物（如短鏈脂肪酸，short-chain fatty acids，SCFAs）產生影響[10?11]，進而影響宿主健康。SCFAs可以直接為腸黏膜細胞提供能量、調節腸道免疫、維持腸道的正常生理功能[12]，此外SCFAs在腸粘膜在自我修復和保持腸上皮細胞的緊密連接及完整性方面具有重要作用[13]。腸內SCFAs的種類和濃度會因為食物和腸道微生態菌群的不同而有所差異[14]。因此SCFAs的含量可以一定程度上反映腸道菌群和腸道健康的狀況。研究發現，SCFAs在盲腸和結腸中含量最高[15]，但由于近端結腸中SCFAs含量遠高于遠端結腸，因此盲腸中SCFAs成分及含量常作為法分析腸道菌群代謝的重要指標[16]。Caesar等[17]研究中發現，高脂飲食對腸道微生物區系的多樣性產生不同的影響，進而導致腸內SCFAs的差異。Schwiertz等[18]研究了高脂誘導小鼠肥胖對其腸道短鏈脂肪酸的影響，與正常飲食小鼠相比，肥胖小鼠腸道中短鏈脂肪酸水平明顯下調。Wan等[19]研究了低脂、中脂和高脂攝入對人體腸道菌群代謝產物的影響，發現高脂組腸道短鏈脂肪酸出現顯著下降。油脂攝入對于腸道中短鏈脂肪酸水平的影響也是近年來的研究熱點。

許多腸道疾病如腸炎、結腸癌等，最常發于結腸[20]，所以結腸形態的觀察對于腸道健康的研究有重要的意義。故本試驗旨在通過動物實驗，初步研究食用羊臀脂及其分提產物對小鼠腸道SCFAs及結腸形態的影響，為羊臀脂及其分提產物的食用健康性的研究提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級昆明雄性小鼠 共60只，18~20 g，由新疆醫科大學動物實驗中心提供，飼養于新疆農業大學動物飼養室（SPF級），溫度維持在24 ℃左右，保持每日12 h光照，濕度50%~60%，實驗動物通過新疆農業大學實驗動物福利委員會批準，批準編號：2019019；阿勒泰羊臀脂（10月齡） 新疆烏魯木齊市米東區新華凌市場；乙酸標準品、丙酸標準品、丁酸標準品、正戊酸標準品、異戊酸標準品 純度99.8%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈 純度99.9%，上海默克化工有限公司；磷酸二氫鈉 分析純，天津致遠化學試劑有限公司；磷酸 分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；甲醛 分析純，山東嘉穎化工科技有限公司；濃鹽酸 分析純，上海氯堿化工股份有限公司。

DZF-6050LC真空干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；DL-3010低溫冷卻液循環泵 上海市百典儀器廠；3H16RI型冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；SPD-20A紫外檢測器（液相色譜儀）、LC-20AB高壓恒流泵（液相色譜儀）、CTO-10AS恒溫柱溫箱（液相色譜儀） 島津公司；ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（25 cm×4.6 mm，5 μm）安捷倫科技（中國）有限公司；UPHW-III-90T超純水機 北京杜伯特科技有限公司；LE204E/02萬分之一天平 上海鑫倉電子科技有限公司；HS-S型組織切片機 沈陽恒松科技有限公司；HRS-22D高清恒染染色機 武漢漢谷醫療科技有限公司；moticBA300顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 阿勒泰羊臀脂分提 原脂的制備：采用何鑫等[6]的方法進行制備，選取新宰殺的阿勒泰羊臀脂，利用真空干燥箱（70 ℃，壓力0.08 MPa，4 h）將阿勒泰脂臀羊臀脂粗提得到原脂，阿勒泰脂臀羊臀脂分提產物的制備：參照李濤等[4]的溶劑法分提并加以優化：羊臀脂原脂與丙酮按1:6（v/v）混合，利用配有溫度設置程序的循環泵，設置起始溫度為32 ℃，保持16 h，使其充分結晶，結晶結束后真空抽濾分離得到固脂，剩余液脂迅速降溫至22 ℃，維持16 h使其充分結晶，結晶結束后真空抽濾分離得到固脂，12、2 ℃溫度處理同上，得到熔點不同的組分：32 ℃分提羊臀脂、22 ℃分提羊臀脂、12 ℃分提羊臀脂、2 ℃分提羊臀脂，于真空干燥箱中揮發殘余丙酮后，密封后?4 ℃冷藏備用。

1.2.2 試驗油脂灌胃前處理 室溫下，原脂、12、2 ℃分提產物呈固態，故參照GB/T 12766-2008中方法對原脂、12和2 ℃分提產物的熔點進行測定，熔點分別為（39.46±0.75）、（39.50±0.62）、（25.30±0.65）℃。灌胃前依次根據熔點溫度恒溫水浴加熱（1~2 min）至液態，直接進行灌胃。

1.2.3 供試動物分組及灌胃劑量 參照我國部分城市5%~10%居民日烹調油日攝入量95 g[21]，折算為試驗灌胃劑量1.5 mL/10 g。

選取小鼠60只，預飼養1周后，隨機分為5組，每組12只，分為2 ℃分提產物組、12 ℃分提產物組、原脂（BF）組、菜籽油（RO）組和空白（CK）組，各組分別用相應油脂灌胃，CK組灌胃生理鹽水。飼養過程中不限制飲食和飲水，每3 d稱重并調整灌胃劑量。分別于第20、40 d禁食12 h，不禁水，稱重，斷頸處死（每次每組處死6只），測量相關指標。

1.2.4 小鼠結腸與盲腸內容物的采集 結腸采集：小鼠斷頸處死后，于無菌操作臺上取出結腸內容物后，將結腸利用生理鹽水沖洗干凈，浸泡于10%甲醛溶液中固定48 h，梯度脫水，浸蠟包埋，采用H&E染色法染色，置數碼顯微鏡下進行病理學觀察。

盲腸內容物的采集：小鼠斷頸處死后，于無菌操作臺上取盲腸內容物，迅速裝入EP管中凍存于液氮中待測。

盲腸內容物的處理：取50 mg凍存的盲腸內容物，按100 mg/mL加入2 mmol/L的HCl，于樣品制備機震蕩60 s后，靜置25 min，于4 ℃、12000 r/min離心30 min，吸取上清液，過0.22 μm水系濾膜后進樣檢測。

1.2.5 盲腸內容物檢測

1.2.5.1 液相色譜條件 參照陳和地等[22]和Faujan等[23]的方法，并加以優化。流動相比例為乙腈:水=14:86（v/v，含25 mmol/ L磷酸二氫鉀溶液緩沖液，pH=2.3），流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫45 ℃，進樣量20 μL。

1.2.5.2 標準曲線繪制 采用外標法定量，以目標短鏈脂肪酸的峰面積為縱坐標（y），以質量濃度為橫坐標（x），進行標準曲線繪制，如表1所示。

表1 短鏈脂肪酸標準曲線方程Table 1 Short-chain fatty acid standard curve equation

1.3 數據處理

采用Excel 2007統計并整理數據，利用Origin9.0軟件作圖，運用SPSS19.0（Duncan法）分析數據差異性，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠盲腸內容物總短鏈脂肪酸含量的變化

短鏈脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸等，他們是腸道細菌發酵膳食纖維和碳水化合物的產物，是腸腔內最豐富的微生物代謝產物之一[24]。由圖1可見，經20 d喂養，各組小鼠盲腸內容物總短鏈脂肪酸含量為：CK組>12 ℃組>BF組>2 ℃組>RO組，其中各油脂處理組均顯著低于CK組（P<0.05），RO組顯著低于12 ℃分提組（P<0.05）。40 d喂養后，各組盲腸內容物總短鏈脂肪酸含量均有所下降，各組盲腸內容物總短鏈脂肪酸含量為：CK組>12 ℃組>2 ℃組>BF組>RO組，且2 ℃組和12 ℃組分別顯著高于RO組44.34%和63.69%（P<0.05）。

圖1 阿勒泰羊臀脂及其分提產物對小鼠盲腸內容物總短鏈脂肪酸含量的影響Fig.1 Effects of Altay sheep buttock fat and its extract on the content of total short chain fatty acids in cecum of mice

2.2 小鼠盲腸內容物乙酸含量的變化

乙酸能調節腸道內環境的pH，從而抑制有害菌的生長繁殖，有助于維持腸道健康[25]，此外，它是膽固醇合成的底物[26]，也是通過中央下丘腦機制抑制食欲的重要物質[27]。由圖2可見，經20 d喂養，各組小鼠盲腸內容物乙酸含量為：CK組>12 ℃組>BF組>2 ℃組>RO組，各油脂處理組間無顯著性差異，且顯著低于CK組（P<0.05）。40 d喂養后，各組盲腸內容物乙酸含量均有所下降，各組盲腸內容物乙酸含量為：CK組>12 ℃組>2 ℃組>BF組>RO組，且2 ℃組和12 ℃組分別顯著高于RO組41.46%和64.87%（P<0.05）。在本試驗中，40 d相較于20 d小鼠其盲腸中乙酸的含量下降，而2、12 ℃、BF和RO組分別降低了11.9%、3.49%、31.70%、31.66%，其中2 ℃組、12 ℃組相較于BF和RO組乙酸含量降低更為平緩，說明分提后的油脂更有利于維持腸道乙酸含量的相對穩定。任燕[28]研究發現，高脂飲食SD大鼠糞便中乙酸的含量要低于標準飲食組，Grant等[29]的研究也發現，高脂低碳水化合物的飲食攝入會對糞便中的SCFAs產生不利影響，這與本試驗結果相似。

圖2 阿勒泰羊臀脂及其分提產物對小鼠盲腸內容物乙酸含量的影響Fig.2 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on the content of acetic acid in the cecum of mice

2.3 小鼠盲腸內容物丙酸含量的變化

丙酸在人體內作為脂肪酸生產的抑制劑，也在腸道中作為一種低級別的消炎劑[30]。此外，丙酸是肝臟蛋白質合成、糖異生和脂異生的前體[31]，它可以通過FFA2受體（也稱為GPCR43）誘導脂肪的形成[32]。由圖3可見，經20 d喂養，小鼠盲腸內容物中丙酸含量為：CK組>BF組>12 ℃組>2 ℃組>RO組，其中RO組顯著低于BF組（P<0.05）。40 d喂養后，各油脂灌胃組丙酸含量均有所下降，小鼠盲腸內容物中丙酸含量為：CK組>12 ℃組>2 ℃組>BF組>RO組，且2和12 ℃組分別顯著高于RO組55.23%和79.07%（P<0.05）。說明長期油脂的攝入會降低小鼠盲腸丙酸的含量，40 d飼養結束后2、12 ℃、BF和RO組相較于20 d飼養結束時，分別降低了10.58%、1.67%、33.29%、27.11%，其中2 ℃分提產物和12 ℃分提產物組丙酸含量降低更為平緩。吳水蕓[33]研究發現，高脂攝入的情況下，小鼠腸道糞便丙酸含量有一定程度的下調，李賀[34]研究觀察到，豬油組和大豆油組大鼠盲腸。短鏈脂肪酸含量低于空白組，這與本試驗結果一致。

圖3 阿勒泰羊臀脂及其分提產物對小鼠盲腸內容物丙酸含量的影響Fig.3 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on the content of propionic acid in the cecum of mice

2.4 小鼠盲腸內容物丁酸含量的變化

丁酸是厚壁菌門的主要代謝產物，能被結腸上皮細胞吸收利用，是結腸、盲腸能量的首選來源[35]，也是組蛋白去乙酰化酶抑制劑，它可以通過調節基因表達決定細胞命運[36]。由圖4可見，經20 d喂養，小鼠盲腸內容物中丁酸含量為：CK組>2 ℃組>12 ℃組>BF組>RO組，各灌胃油脂組間不存在顯著性差異（P>0.05）。40 d喂養后，小鼠盲腸內容物中丁酸含量為：CK組>12 ℃組>2 ℃組>BF組>RO組，各灌胃油脂組盲腸丁酸含量相較于20 d均有所降低，2和12 ℃組分別顯著高于RO組48.41%和58.67%（P<0.05）。與20 d相比，喂養40 d后，各油脂灌胃組的丁酸濃度出現下降現象，2、12 ℃、BF和RO組分別降低了18.70%、11.95%、19.72%、20.65%。Greta等[37]的研究也發現了高脂肪飲食會減少了丁酸鹽的形成。Kong等[38]發現，高糖和高脂飲食的攝入會降低微生物多樣性和有益生菌的豐度，如丁酸產生菌的豐度，從而導致丁酸含量降低，這可能是本試驗中隨著喂養時間延長丁酸含量下降的原因。

圖4 阿勒泰羊臀脂及其分提產物對小鼠盲腸內容物丁酸含量的影響Fig.4 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on the content of butyric acid in the cecum of mice

2.5 小鼠盲腸內容物異戊酸含量的變化

由圖5可見，經過20 d的喂養，小鼠盲腸內容物中異戊酸含量為：CK組>2 ℃組>12 ℃組>BF組>RO組，2和12 ℃組分別顯著高于RO組116.97%、68.89%（P<0.05）。40 d喂養后，小鼠盲腸中異戊酸含量為：CK組>2 ℃組>12 ℃組>BF組>RO組，2 ℃組顯著高于RO組83.88%（P<0.05），各灌胃油脂組盲腸異戊酸含量相較于20 d均有所降低。2、12 ℃、BF和RO組，其異戊酸含量在40 d飼養結束后相較于20 d分別降低了22.60%、16.60%、20.67%、8.67%，RO組相較于其他油脂攝入組，降低幅度較小。Ye等[39]也發現與本研究類似的結果，高脂攝入后空白小鼠結腸內容物異戊酸含量顯著高于各油脂攝入組。

圖5 阿勒泰羊臀脂及其分提產物對小鼠盲腸內容物異戊酸含量的影響Fig.5 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on isovaleric acid content in the cecum of mice

2.6 小鼠盲腸內容物戊酸含量的變化

由圖6可知，經20 d喂養，小鼠盲腸內容物中戊酸的含量為：CK組>RO組>2 ℃組>12 ℃組>BF組，CK組顯著高于其余各組（P<0.05），各灌胃油脂組盲腸中戊酸含量無顯著性差異（P>0.05）。40 d喂養后，小鼠盲腸內容物中戊酸含量為：CK組>2 ℃組>12 ℃組>RO組>BF組，各灌胃油脂組盲腸內容物戊酸含量無顯著性差異（P>0.05），但各灌胃油脂組盲腸異戊酸含量相較于20 d均有所降低。在本試驗中，2、12 ℃、BF和RO組，其戊酸含量40 d飼養結束后相較于20 d分別降低了5.69%、19.01%、4.95%、23.12%。黃玉軍等[40]研究發現高脂飲食會引起大鼠糞便中的戊酸含量下降，Ji等[41]的研究發現，高脂飲食組的戊酸含量低于空白對照組，這與本試驗結果一致。

圖6 阿勒泰羊臀脂及其分提產物對小鼠盲腸內容物戊酸含量的影響Fig.6 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on the content of valeric acid in the cecum of mice

2.7 羊臀脂及其分提產物對小鼠結腸形態學的影響

高脂飲食不僅可以誘導腸道微生物區系產生的SCFAs發生改變，而且還可能導致結腸損傷[42]。結腸絨毛的長度和隱窩深度，是影響腸道健康和生長性能的重要指標[43]。因此，研究了阿勒泰羊臀脂及其分提產物對小鼠結腸隱窩深度、絨毛高度和組織形態的影響。如圖7所示，20 d飼養結束后，CK組小鼠結腸隱窩深度均顯著高于2 、12 ℃、BF和RO組（P<0.05），12 ℃和BF組的隱窩深度分別顯著低于RO組11.26%、18.96%（P<0.05），40 d飼養結束后，CK組小鼠結腸隱窩深度均顯著高于2 、12 ℃和BF組（P<0.05），2、12 ℃和BF組隱窩深度分別顯著低于RO組14.28%、16.22%和15.88%（P<0.05）。由圖8可知，20 d飼養結束后，CK組小鼠結腸絨毛長度均顯著高于2 、12 ℃、BF和RO組（P<0.05），12 ℃和BF組的絨毛長度分別顯著低于RO組8.04%、16.19%（P<0.05）。40 d飼養結束后，2 、12 ℃和BF組之間結腸絨毛長度存在顯著性差異（P<0.05），且12 ℃和BF組分別顯著低于RO組6.09%和15.70%（P<0.05）。如圖9所示，各油脂灌胃組和CK組相比，結腸絨毛中空腔較多，可能會干擾腸絨毛對機體必需營養物質的吸收。如圖10所示，12 ℃和BF組小鼠結腸組織損傷要高于2 ℃和RO組，與20 d結腸形態相比，結腸絨毛長度下降，且空腔增多。這些結果表明，長期高脂攝入阿勒泰羊臀脂分提產物導致結腸組織的損傷的概率要低于菜籽油和羊臀脂原脂。葉展[44]研究發現棕櫚油和豬油組的結腸絨毛長度和隱窩深度均低于對照組，通過結腸H&E切片可看到清晰的結腸絨毛結構和腸絨毛的刷狀邊緣，棕櫚油和豬油組結腸絨毛的底部出現了初步的損傷狀態。這與本研究中的結果相類似。

圖7 阿勒泰羊臀脂及其分提產物對小鼠結腸隱窩深度的影響Fig.7 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on the depth of colonic crypts in mice

圖8 阿勒泰羊臀脂及其分提產物對小鼠結腸絨毛長度的影響Fig.8 Effects of Altay sheep buttock fat and its fractions on the length of mouse colon villus

圖9 20 d飼養小鼠結腸形態學觀察Fig.9 Morphological observation of the colon of mice fed for 20 days

圖10 40 d飼養小鼠結腸形態學觀察Fig.10 Morphological observation of the colon of mice fed for 40 days

3 結論

在95 g每日的攝入水平下，研究羊臀脂原脂、菜籽油和阿勒泰羊臀脂分提產物對小鼠盲腸短鏈脂肪酸含量和結腸形態的影響。與原脂和菜籽油相比，阿勒泰羊2 ℃分提產物更有利于維持盲腸內容物SCFAs含量的相對穩定。2 ℃分提產物的結腸隱窩深度和絨毛長度大于其他各組，觀察結腸H&E切片發現2 ℃分提產物對于結腸的損傷小于原脂和12 ℃分提產物。這說明阿勒羊臀脂在分提后其營養特性有所增強。研究結果可以為阿勒泰羊臀脂及其分提產物對腸道環境的影響提供一定理論支撐，啟示還可以進一步的深入研究其對腸道微生物組成的影響。