樺褐孔菌與其固體發酵物對2型糖尿病大鼠的氧化應激損傷作用

王 歡，王麗瑩，劉俊澤，唐 敏，陳長寶，王淑敏

（長春中醫藥大學，吉林長春 130117）

近年來，隨著社會的發展、科學的進步，人們對大型真菌的研究越來越深入，發現許多大型真菌具有很好的藥用價值，長期以來蘑菇（大型真菌）作為功能性食品和藥品被人們廣泛應用和認可[1?4]，例如靈芝、桑黃、冬蟲夏草、黑木耳、香菇、灰樹花、茯苓等真菌，而樺褐孔菌Inonotus obliquus（Fr.）Pilát是最具發展前景的藥用真菌之一[5?6]。樺褐孔菌Inonotus obliquus（Fr.）Pilát，又名白樺茸、樹蘑菇、西伯利亞靈芝等，有“森林鉆石”的美譽，隸屬銹革孔菌科，褐臥孔菌屬。在外文文獻中，學名常以Inonotus obliquus、Fuscoporia oblique出現。俗名為Birch mushroom、Black Birch touchwood、茶卡（Чага）等[7?8]。主要分布于俄羅斯、中國、日本、北歐的波蘭和荷蘭等國家[9?13]，早在16世紀初期，世界上就開始有人食用樺褐孔菌來用于治療糖尿病、腫瘤、肝病、胃病等[14?17]，同時，還具有免疫調節、抗疲勞抗炎、抗病毒等生物活性[18?21]，因此樺褐孔菌有著悠久的歷史應用背景。近年來，我國對食藥用研究十分重視，樺褐孔菌的相關研究炙手可熱，但由于樺褐孔菌的生長環境和生長年限的限制，樺褐孔菌在自然環境下生長多年才能獲得較大菌核，野生資源十分珍貴，這使得樺褐孔菌藥理活性和藥效研究沒有得到更好的發展。

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是一類以持續高血糖和血脂異常為主要特征的代謝類疾病。文獻中廣泛的報道了炎癥反應與糖尿病密切相關，TNFα是一種主要由單核巨噬細胞產生的具有廣泛生物活性的細胞因子，可誘導IL-1、IL-6的合成[22]。近年來研究發現，TNF-α可抑制胰島素信號以及胰島素調節下的葡萄糖的攝取，表明胰島素抵抗的發生可以由TNF-α介導產生[23]。戚琛曄等[24]發現氧化應激反應與糖尿病存在密切相關，氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷。超氧化物歧化酶SOD，是一種源于生命體的活性物質，能夠迅速清除線粒體呼吸鏈電子傳遞過程中產生的超氧陰離子自由基，減輕機體氧化應激狀態，保護細胞免受損傷。細胞脂質過氧化程度可以用丙二醛（MDA）的含量高低表示，MDA含量的降低可能意味著機體對抗氧化損傷能力增強[25?26]。

因此，研究組利用固體發酵技術對樺褐孔菌進行了深入研究，并比較了樺褐孔菌（菌粉）、樺褐孔菌水提物、固體發酵物（菌粉）、固體發酵物水提物對高糖高脂飲食+STZ誘導的2型糖尿病大鼠體重、血糖、口服糖耐量及機體炎癥和氧化應激水平的影響。本研究不但緩解了樺褐孔菌野生資源匱乏的問題，同時，評價了固體發酵物是否具有代替野生樺褐孔菌的潛力，并且對比了經過提取和直接灌胃菌粉的藥理作用差別，為進一步研究其藥理作用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌 采自長白山，經長春中醫藥大學王淑敏教授鑒定為樺褐孔菌Inonotus obliquus（Pers.）Pilát），標本現保存于長春中醫藥大學，固體發酵產物由吉林省菌物藥生物技術工程實驗室提供；STZ 美國Sigma 公司；二甲雙胍 中美上海施貴寶制藥有限公司；TNF-α，IL-6，IL-1β，MDA，SOD酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒 上海源葉生物技術有限公司；110只雄性SD大鼠（180~220 g） 遼寧長生生物技術有限公司，動物合格證號：SCXK（遼）2015-0001，合格證編號：NO.2110023000118343。

TYS-200高速多功能粉碎機 浙江永康市紅太陽機電有限公司；恒溫水浴鍋 常州市江南實驗儀器廠；AUY220分析天平 島津國際貿易上海有限公司；酶標儀 Rayto RT-6000；TGL16M臺式高速冷凍離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；血糖儀三諾生物傳感股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的提取 以薏米:麥麩:樺樹汁=2:1:8為最佳發酵基質，在30 ℃條件下對樺褐孔菌進行固體發酵，得到固體發酵產物。取樺褐孔菌2.0081 g，固體發酵產物2.0104 g，加8倍量的水浸泡30 min，煎提3次，每次30 min，合并3次水煎液，濃縮，水浴蒸干，得樺褐孔菌水提物0.2607 g，樺褐孔菌固體發酵產物水提物0.6112 g。即樺褐孔菌的出膏率為12.98%，樺褐孔菌固體發酵產物的出膏率為30.40%。

1.2.2 分組及給藥 SD大鼠隨機分為11組，每組10只：空白組（生理鹽水）；模型組；陽性藥組（二甲雙胍，0.2 g/kg）；樺褐孔菌水提物（WIO）組（0.4、0.8 g/kg）；樺褐孔菌菌粉（IO）組（3.08、6.16 g/kg）；固體發酵物水提物（WSFIO）組（0.4、0.8 g/kg）；固體發酵物（SFIO）組（1.3、2.6 g/kg）。

1.2.3 造模 SPF級大鼠，雄性，隨機選取10只作為正常對照組，常規飼料喂養，其他大鼠喂養高脂高糖飼料6周，6周后單次小劑量腹腔注射STZ（50 mg/kg）誘導2型糖尿病模型（1% STZ溶解在檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mmol/L，pH4.4）中，在半小時內注射完），空白組以同樣的方式腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，一周后，禁食但不禁水，尾靜脈取血，血糖試紙測定空腹血糖值FBG，其中FBG≥7.8 mmol者為Ⅱ型糖尿病模型成功[27?28]。

1.2.4 口服糖耐量實驗（OGTT） 造模過程中每周記錄大鼠體重變化。實驗結束前，禁食24 h但不禁水，尾靜脈取血后應用血糖儀測定并記錄血糖值即空腹血糖值FBG，以獲得基線血糖水平。隨后，各組大鼠灌胃葡萄糖溶液（2 g/kg），灌胃后采用血糖儀分別在0、30、60、90、120 min測定并記錄血糖值[29]。

1.2.5 生化指標檢測 給藥結束后，迅速收集血清，采用ELISA試劑盒測定大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、SOD和MDA的水平，評價樺褐孔菌及其固體發酵物對糖尿病大鼠機體氧化應激及炎癥反應的影響。

1.3 數據處理

本實驗采用GraphPad Prism 8.0軟件統計和作圖。所有數據均以“均值±標準差”表示。通過單因素方差分析與Tukey多重比較檢驗比較組間差異。P<0.05表明具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 樺褐孔菌對糖尿病大鼠體重的影響

由表1可知，從第5周開始，SD大鼠開始出現“三多一少”表現，與空白組比較，模型組大鼠體重顯著降低（P<0.001）。給藥后，與模型組比較，IO低高劑量組大鼠體重第5周開始顯著升高；WIO低劑量組第10周開始顯著升高（P<0.01）；WSFIO高劑量組第9周開始顯著升高（P<0.05），且優于陽性藥組。研究表明，樺褐孔菌菌粉及其水提物和固體發酵水提物均能顯著增加糖尿病大鼠體重，緩解體重持續減輕問題。

表1 樺褐孔菌對糖尿病大鼠體重的影響（xˉ±s, g, n=10）Table 1 Effects of I. obliquus on body weight of the diabetic rats (xˉ±s, g, n=10)

2.2 對大鼠口服糖耐量的影響

由表2可知，葡萄糖灌胃后，血糖開始逐漸升高，30~60 min后開始下降，與空白組比較，模型組大鼠血糖顯著升高（P<0.001），與模型組比較，陽性藥組和樺褐孔菌各給藥組血糖值均有降低的趨勢，SFIO 1.3 g/kg和SFIO 2.6 g/kg在葡萄糖灌胃30 min后顯著降低（P<0.01；P<0.05），分別降低了29.1%和25.4%，張等[30]的研究表明，樺褐孔菌總多糖（400、800 mg/kg）給藥兩周后血糖分別降至18. 97和12.66 mmol/L，而本研究中的給藥組均可達到近似或更優效果，提示樺褐孔菌固體發酵物能相對較好地改善大鼠口服糖耐量，效果優于其他給藥組。

表2 樺褐孔菌對糖尿病大鼠口服糖耐量的影響（xˉ±s, mmol/L, n=10）Table 2 Effects of I. obliquus on oral glucose tolerance of the diabetic rats (xˉ±s, mmol/L, n=10)

2.3 樺褐孔菌對糖尿病大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的影響

由表3可知，給藥 8 周后，與空白組比較，模型組大鼠血清中炎癥因子 IL-6的水平極顯著升高（P<0.01），與模型組相比，陽性藥組可顯著降低血清中IL-6的含量（P<0.05），樺褐孔菌各給藥組在不同程度上可降低血清中IL-6的水平，但無顯著性差異（P?0.05）。

表3 樺褐孔菌對糖尿病大鼠血清中IL-6，IL-1β，TNF-α水平的影響（xˉ±s，n=10）Table 3 Effects of I. obliquus on IL-6，IL-1β and TNF-α levels in serum of the diabetic rats (xˉ±s, n=10)

與空白組比較，模型組大鼠血清中炎癥因子IL-1β的水平顯著升高（P<0.05），與模型組相比，陽性藥組、WIO 低高劑量組、WSFIO 低劑量組均可顯著降低血清中IL-1β的水平（P<0.05）。

與對照組比較，大鼠血清中炎癥因子TNF-α的水平極顯著升高（P<0.01），與模型組相比，陽性藥組、IO 低高劑量組、WIO低劑量組、SFIO 低高劑量組和WSFIO 高劑量組均可顯著降低血清中TNF-α的水平。

2.4 樺褐孔菌對糖尿病大鼠血清中SOD和MDA的影響

由表4可知，給藥 8 周后，與空白組比較，模型組大鼠血清中SOD的水平極顯著降低（P<0.001），與模型組相比，陽性藥組和樺褐孔菌各給藥組在不同程度上均可顯著提高血清中SOD的水平（P<0.05，P<0.001或P<0.001）。結果不難看出，水提后得到的提取物的SOD水平較直接菌粉給藥均有所降低。

與空白組比較，模型組大鼠血清中丙二醛MDA的水平顯著升高（P<0.001），與模型組相比，陽性藥組和樺褐孔菌各給藥組均可降低血清中MDA的水平（P<0.01或P<0.001）。提示樺褐孔菌固體發酵物具有較好的抗氧化活性。

3 結論

本研究研究了樺褐孔菌及其固體發酵物對2型糖尿病大鼠機體的保護作用，結果表明，樺褐孔菌子實體及其固體發酵產物可以降低鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，顯著上調SOD的含量、降低MDA的含量，改善氧化應激反應，改善糖尿病大鼠口服糖耐量，抑制糖尿病大鼠體重的減輕，揭示樺褐孔菌固體發酵物具有良好的抗炎及抗氧化活性。

直接以菌粉、固體發酵物或二者的水提物給藥對各個指標的影響不一，水提與直接粉碎（菌粉）給藥結果有一定差異，對體重減輕的改善樺褐孔菌菌粉（IO）優于其水提物（WIO），WSFIO高劑量組優于SFIO組；固體發酵物SFIO組對口服糖耐量的調節優于其他給藥組；WIO低、高劑量組和WSFIO高劑量組對IL-1β的降低作用優于其他給藥組；IO低、高劑量組，WIO 低劑量組，SFIO低、高劑量組和WSFIO高劑量組對TNF-α的抑制作用優于其他劑量組；各給藥組均可提高SOD的水平，其中IO、SFIO和WSFIO組效果基本相當，且優于WIO組；各給藥組均可抑制MDA的水平，其中IO、WIO和WSFIO組效果基本相當，且優于SFIO組?？傮w來說，固體發酵物具有代替野生樺褐孔菌改善2型糖尿病的炎癥及氧化應激潛能，其發酵工藝也需要進一步深入研究。